正相高效液相色谱法测定腌腊肉制品中磷脂酰胆碱氢过氧化物的含量

任 双，宋 慧，耿志明，王道营，张牧焓，孙 冲，徐为民，*（1.南京农业大学 肉品加工与质量控制教育部重点实验室，江苏 南京 10095；.江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏 南京 10014；3.江苏省肉类生产与加工质量安全控制协同创新中心，江苏 南京 10095）



正相高效液相色谱法测定腌腊肉制品中磷脂酰胆碱氢过氧化物的含量

任 双1，2，3，宋 慧1，2，耿志明2，王道营2，张牧焓2，孙 冲2，徐为民1，2，3，*
（1.南京农业大学 肉品加工与质量控制教育部重点实验室，江苏 南京 210095；2.江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏 南京 210014；3.江苏省肉类生产与加工质量安全控制协同创新中心，江苏 南京 210095）

采用正相高效液相色谱法对腌腊肉制品中的磷脂酰胆碱氢过氧化物（PC-OOH）进行检测。腌腊肉制品中的PC-OOH用氯仿-甲醇（2∶1，V/V）提取，以合成的C16∶0/18∶2PC-OOH为标样，采用正相高效液相色谱-紫外法进行检测。色谱柱：Lichrosorb Si60（250 mm×4.0 mm，5 μm）；流动相：A为水，B为正己烷-异丙醇（3∶2，V/V），采用梯度洗脱；流速：1 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：234 nm。结果表明：C16∶0/18∶2PC-OOH在20～600 nmol/mL范围内呈现良好的线性关系（R2=0.999 9），检出限为5.8 nmol/mL，定量限为19.4 nmol/mL，不同水平的平均回收率为79.4%～91.9%。实际样品分析显示，农家腊肠A、B和火腿中方样品中PC-OOH的含量比较高，为92.4、106.4 nmol/g和102.5 nmol/g，烟熏肉中未检出PC-OOH。本实验建立的分析方法简便快捷、具有较好的灵敏度和可靠性，可用于腌腊肉制品中PC-OOH的定量分析。

腌腊肉制品；1-棕榈酰-2-亚油酰-磷脂酰胆碱；氢过氧化物；正相高效液相色谱法

在光、金属离子、酶等存在的条件下，脂质发生氧化反应，产生初级氧化产物——脂质氢过氧化物（hydroperoxides，HPs）。脂质HPs进一步降解形成一系列挥发性和非挥发性次级氧化产物，是食品酸败、产生异味的主要原因［1-2］。脂质氧化降低食品的营养价值和品质安全，其产物与多种疾病的形成与发展相关，如心血管疾病［3］、阿尔茨海默氏病［4］、癌症［5］和衰老［6］。磷脂是细胞膜和血清脂蛋白的主要成分，多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）含量显著高于脂肪酸甘油酯，因此有关磷脂HPs，尤其是磷脂酰胆碱HPs （PC-OOH）的研究，是脂质氧化的研究重点［7］。在现有的脂质HPs分析方法中，碘量法［8］、比色法［9］和硫代巴比妥酸法［10］等主要用于脂质HPs总量的测定，缺乏选择性，不适用于PC-OOH的分析。基于谷胱甘肽过氧化物酶和环氧化酶的一些酶促反应方法［11］，具有较好的选择性和灵敏度，但是这些酶通常都难以获得。高效液相色谱-柱后衍生分析法和高效液相色谱-串联质谱法，均具有优异的选择性和灵敏度，满足食品及生物样本中包括PC-OOH在内的脂质HPs的定性定量分析，但前者由于衍生反应自身的局限，缺少稳定性，而后者运行费用昂贵、难以普及。高效液相色谱-紫外检测器分析法［12-14］，利用PUFA氧化后产生的共轭双键在234 nm波长处的特征吸收，对其HPs进行定性、定量分析。高效液相色谱-紫外检测器分析法适用于含共轭双键的脂肪酸HPs的分析，具有较好的选择性和灵敏度，操作简便且无需昂贵设备及设施。这一方法早期多用于脂质氧化模拟体系中亚油酸（linoleic acid，LA）及其甲酯的初级氧化产物LA-OOH的分析，随后被成功应用于包括PC-OOH在内的人体红细胞膜磷脂HPs的分析，但尚未见其应用于动物性食品中磷脂HPs分析的研究报道。

腌腊肉制品是以畜禽肉类为原料，在低温条件下，通过加盐（或盐卤）和香料进行腌制，经过长时间的自然风干成熟，形成独特腌腊风味的传统肉制品。动物肌肉中的磷脂（亦称肌内磷脂）占肌内总脂肪的50%以上，肌内磷脂中PC占45%～60%［15］。磷脂中的多不饱和脂肪酸是脂质氧化反应最主要的靶标［12］，对于腌腊肉制品的生产工艺而言，脂质氧化、尤其是肌内磷脂氧化是最主要的生化反应，是风味物质的主要来源，在某种程度上决定了产品品质，因此对磷脂氧化进行必要的监测与调控至关重要［16-17］。目前通常采用过氧化值、硫代巴比妥酸、双烯值以及羰基值等的检测，评价腌腊肉制品中脂质氧化的程度。但对于脂质氧化产物类别、产生途径，并在此基础上对脂质氧化进行调控无法足够的信息。本实验通过自由基氧化法，制备肌内磷脂中最常见的磷脂酰胆碱分子种C16∶0/18∶2PC的氢过氧化物（C16∶0/18∶2PC-OOH），并以此为PC-OOH标样，建立腌腊肉制品中PC-OOH的高效液相色谱分析方法。样品中的PC-OOH经提取、浓缩后，在硅胶柱上分离，通过二极管阵列检测器（diode array detector，PAD）在234 nm波长处进行检测。本实验建立的方法操作简便、快捷，拥有良好的灵敏度。这一方法可用于腌腊肉制品生产过程中磷脂酰胆碱氧化的监测，也可用于肉制品加工过程中磷脂酰胆碱氧化途径、及其对脂质氧化贡献等相关研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

农家腊肠、苏式腊肠、烟熏肉 市购。

磷脂酰胆碱标准品（C16∶0/18∶2PC，纯度99%） 美国Sigma公司；异丙苯过氧化物 加拿大TRC公司；甲醇、氯仿、正己烷、异丙醇（均为色谱纯） 美国Tedia公司；自由基诱导剂2，2′-偶氮二异庚腈（纯度99%） 上海一基实业有限公司；三苯基磷化合物（1，3-bis（diphenylphosphino）propane，DPPP，纯度95%）东京化成工业株式会社；水由纯水仪（美国Millipore公司）制备；其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

e2695高效液相色谱（PAD） 美国Milford公司；Biofuge stratos高速离心机 德国Heraeus公司；HS2060A超声波振荡器 常州国华电器有限公司；烘箱上海索谱仪器有限公司；RE-85C真空旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 C16∶0/18∶2PC-OOH标品的制备

［18］方法，并略做修改。称取20.0 mg标品C16∶0/18∶2PC溶于5 mL甲醇，再加入20.0 mg自由基诱导剂2，2′-偶氮二异庚腈，在黑暗中，30 ℃条件下反应24 h。反应结束后再加入2，6-二叔丁基对甲酚（2，6-di-tertbutyl-4-methylphenol，BHT），防止C16∶0/18∶2PC-OOH进一步转化。制得未知浓度的C16∶0/18∶2PC-OOH标准溶液，根据文献［19-20］选择贮存条件为-20℃，保存期：1 个月。

1.3.2 C16∶0/18∶2PC-OOH标品的定量

按参考文献［21］，并略做修改。首先使用荧光分光光度计建立过氧化值（peroxide value，POV）标曲，取0.5、2、4、6、8 nmol异丙苯过氧化物，分别加入装有0.8 mL 3 μg/mL DPPP溶液的试管中，最后定容为1.6 mL。60 ℃烘箱中反应1 h，冰水浴30 min，然后使用荧光分光光度计检测，激发波长352 nm，发射波长380 nm，建立POV标准曲线。

与此同时，取100 μL上述C16∶0/18∶2PC-OOH溶液，加入装有0.8 mL 3 μg/mL DPPP溶液的试管中，最后定容为1.6 mL。60 ℃烘箱中反应1 h，冰水浴30 min，然后使用荧光分光光度计检测。根据上面的POV标准曲线，得到C16∶0/18∶2PC-OOH的质量浓度。

1.3.3 标准溶液的配制

取适量1.3.2节中定量的C16∶0/18∶2PC-OOH溶液，用甲醇稀释，配制800 nmol/mL C16∶0/18∶2PC-OOH储备液。用移液管吸取适量标准储备溶液，用流动相B（正己烷-异丙醇，3∶2，V/V）稀释配制物质的量浓度为20、80、240、420、600 nmol/mL的C16∶0/18∶2PC-OOH系列工作溶液，储存于-20℃，1 个月以内使用。

1.3.4 样品处理

根据Folch等的方法［22］，略作修改提取脂质。样品粉碎后，取3.0 g 于80 mL离心管中，加入20 mL含有0.1% BHT的氯仿-甲醇（2∶1，V/V）溶液，低速匀浆后再加入25 mL氯仿-甲醇，静置1 h，5 000 r/min离心15 min，过滤后滤渣中再加入15 mL氯仿-甲醇，合并2 次的滤液，加入0.3 倍体积的生理盐水（7.3 g/L NaCl，0.5 g/L CaCl2），然后3 000 r/min离心15 min，吸净上层液体，剩余液体用真空旋转蒸发器真空蒸干，最后加入氯仿溶解，定容至2.0 mL，在-20 ℃贮存备用。

1.3.5 色谱条件

色谱柱：Lichrosorb Si60（250 mm×4.0 mm，5 μ m）；流动相：A为水，B为正己烷-异丙醇（3∶2，V/V）；梯度洗脱（表1），流速：1 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：234 nm；进样量：20 μL。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradient eluti on p rogram

1.3.6 重复性实验

配制不同质量浓度的C16∶0/18∶2PC-OOH标准溶液，进行正相高效液相色谱测定，以测定的结果计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.7 精密度实验

取一份农家腊肠样品A，在1 d的不同时段对样品进行6 次正相高效液相色谱测定，连续4 d每天测定一次，以测得的结果分别计算日内和日间的标准偏差。

1.3.8 回收率实验

称取3.01 g农家腊肠样品B，根据其PC-OOH含量添加不同水平的C16∶0/18∶2PC-OOH标准品，按1.3.4节样品处理步骤进行实验，测定PC-OOH含量，计算回收率，样品做3 次平行实验。

2 结果与分析

2.1 样品处理条件的优化

腌腊肉制品水分低，蛋白质含量高，按Folch等［22］的方法进行提取，C16∶0/18∶2PC-OOH的提取率很低。本实验将生理盐水的用量从0.2 倍提高到0.3 倍，同时对滤渣进行第2次萃取、离心分离，极大地提高了C16∶0/18∶2PCOOH提取率，最终C16∶0/18∶2PC-OOH的回收率达到79.4%～91.9%。

在磷脂的分离及定量分析中，常采用固相萃取（solid phase extraction，SPE）小柱（如氨丙基硅胶小柱）对磷脂进行分离、净化、浓缩［22-23］。在本实验中，也尝试使用了硅胶柱、氨基柱等SPE小柱，但这些小柱并未对样品中C16∶0/18∶2PC-OOH有显著的净化、浓缩作用，甚至SPE小柱的使用反而降低了回收率。图1、2分别是C16∶0/18∶2PC-OOH标准品和样品的色谱图，C16∶0/18∶2PCOOH与杂质峰实现基线分离，本实验确定的样品处理方法具有理想的提取、净化效果，满足腌腊肉制品中PCOOH分析的要求。

图1 240 n mol /m L C16∶0 /18∶2P C-O O H 在234 nm波长处的高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of C16∶0/18∶2 PC-OOH （240 nmol/mL） detected at234 nm

图2 农家腊肠样品 B 中106.4 nmo l/g P C-O O H 的高效液相色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of PC-OOH （106.4 nmol/g） in farm-made sausage B sample

2.2 色谱条件的优化

PC是一种两性分子，由亲水的头部和疏水的尾部组成，呈弱极性，而PC-OOH的极性略强于PC。高效液相色谱法分析PC-OOH时可采用反相色谱柱分离［14，19，24］、也可采用正相色谱柱分离［12-13］。本实验在比较了反相色谱柱（C18）、正相柱（氨基柱、硅胶柱）分离腌腊肉制品中PC-OOH的效果后，选择以硅胶柱（Lichrosorb Si60）为色谱柱，主要是因为使用反相柱和氨基柱时，PC-OOH出峰太快，与其他磷脂类物质的氢过氧化物的分离效果不好。

为了得到最佳的分离效果，分别配制了3 种流动相体系：不同比例的乙腈-甲醇-水、正己烷-异丙醇和正己烷-异丙醇（3∶2，V/V）-水，观察三者对PC-OOH在硅胶柱上保留行为的影响。结果发现，正己烷-异丙醇（3∶2，V/V）-水组成的流动相下PC-OOH的峰形最好，流动相中水的增加有利于缩短保留时间、增加峰高，但水含量的上升影响流动相互溶，同时对硅胶色谱柱带来不利影响。采用等度洗脱时，PC-OOH出峰太快，不能与周围的杂质峰分离开。在综合考虑后确定了表1中的流动相组成以及梯度洗脱方式。

PUFA氧化形成的初级产物含有共轭双键，其在234 nm波长处的特征性紫外吸收为采用紫外检测器或PAD检测成为可能。本实验采用PAD观察了C16∶0/18∶2PC-OOH在190～400 nm波长范围的吸收，结果表明合成的C16∶0/18∶2PCOOH以及样品中的PC-OOH同样在234 nm波长条件下有最大吸收峰，且在234 nm波长条件下基线平稳（图1）。

本实验还观察了温度、流速对C16∶0/18∶2PC-OOH在正相硅胶柱上的保留行为的影响，二者对C16∶0/18∶2PC-OOH的保留时间有一定影响，但对检测灵敏度影响不大，最终将温度设为30 ℃，流速1.0 mL/min。在设定的色谱条件下，C16∶0/18∶2PC-OOH出峰时间在25.3～26.8 min，样品中的PC-OOH出峰时间为24.8～26.8 min（图1、2）。

亚油酸含有两个C=C双键，自由基诱导的C16∶0/18∶2PC的初级氧化产物C16∶0/18∶2PC-OOH有4 个异构体［25-26］。在高效液相色谱的分析方法中，由于采用的色谱柱及流动相的差异，这4个异构体常呈现1 个色谱峰或2、3个相连的色谱峰［18，27］。在本实验设立的色谱分离条件下，合成的C16∶0/18∶2PC-OOH标样呈现出2 个相连的色谱峰，而在腌腊肉制品的色谱图中，PC-OOH出峰时间比C16∶0/18∶2PCOOH有所提前，且呈现出3 个相连的色谱峰。磷脂中的多不饱和脂肪酸是脂质氧化反应最主要的标靶，反应形成的共轭双键使得利用紫外检测器或PAD在234 nm波长处检测PC-OOH成为可能［12］。在动物肌肉内PC的sn-2上，主要是亚油酸（C18∶2），还有少量的花生四烯酸（C20∶4）；而在PC的sn-1上，除棕榈酸（C16∶0）外，还有少量的硬脂酸（C18∶0）和亚油酸（C18∶1）［15］。正是由于动物肌内磷脂的PC分子种存在多样性，以及腌腊肉制品加工过程中脂质氧化的复杂性（酶促氧化、自由基诱导的自动氧化同时存在），样品中的PC-OOH为多种PC分子种的氢过氧化物的混合物［14，25，28］，它们的分子质量都大于C16∶0/18∶2PC-OOH的分子质量，经过正相硅胶柱的分离，保留时间有所提前，并且色谱图比C16∶0/18∶2PC-OOH标样更加复杂。虽然PC-OOH呈现出多个色谱峰相连的现象，但其总面积反应的是不同共轭双键（包括不同异构体以及不同PC分子种）的总吸收。鉴于动物肌肉中PC的sn-1以棕榈酸为主、sn-2以亚油酸为主，以合成的C16∶0/18∶2PCOOH为标样、以nmol/g为单位定量样品中PC-OOH的总量是合理的，也是可行的。

2.3 线性范围及最低检出限

配制物质的量浓度为20、80、240、420、600 nmol/mL 的C16∶0/18∶2PC-OOH系列标准工作溶液。在234 nm波长处进行正相高效液相色谱测定分析，以C16∶0/18∶2PC-OOH物质的量浓度/（nmol/mL）为横坐标X，以对应峰面积为纵坐标Y，绘制标准曲线。回归方程Y=11 150X-47 379，相关系数R2=0.999 9。由此可见在20～600 nmol/mL范围内，C16∶0/18∶2PC-OOH浓度与峰面积有良好的线性关系。

按照3 倍信噪比（RSN=3）和10 倍信噪比（RSN=10）计算方法的检出限和定量限，检出限为5.8 nmol/mL，定量限为19.4 nmol/mL。按1.3.4节样品处理换算，样品中的PC-OOH的检出限为3.9 nmol/g，定量限为12.9 nmol/g。

2.4 重复性实验结果

配制32、64、95 nmol/mL的C16∶0/18∶2PC-OOH标准溶液，按照1.3.5节色谱条件进行分析，每个浓度重复操作3 次，记录峰面积，得32、64、95 nmol/mL的C16∶0/18∶2PCOOH标准溶液峰面积的RSD分别为1.1%、0.9%、0.3%，结果表明本实验建立的方法具有良好的重复性。

2.5 精密度实验结果

本方法的精密度通过对农家腊肠样品A中PC-OOH的日内和日间实验来评价的，实验结果见表2和表3。PCOOH精密度（RSD）的范围为1.2%～2.6%，表明本实验所建立的检测方法具有较好的精密度。

表2 日内精密度实验结果Table 2 Intra-day precisi on of the method for determ in ati on of PC-OOH

表3 日间 精密 度实 验结 果Table 3 Inter-day precisi on of the method for determ in ati on of PC-OOH

2.6 回收率实验结果

称取3.0 g农家腊肠样品B于离心管中，分别加入低、中、高水平的C16∶0/18∶2PC-OOH标准溶液，然后按1.3.4节进行样品处理，按1.3.5节色谱条件进行正相高效液相色谱检测，计算回收率，结果见表4。

表4 C 16∶0/18∶2PC-OO H不 同添 加水 平回 收率 测定 结果 （n=3）Table 4 Recoveries of C1 6∶0/18∶2PC-OO Ha td ifferentspi ked lev els（n= 3）

由表4可以看出，样品回收率在79.4%～91.9%之间，平均回收率为87.5%。

2.7 实际样品分析

为了进一步验证本实验建立的腌腊肉制品中磷脂酰胆碱氢过氧化物的检测方法，本实验分别分析了农家腊肠A、B和苏式香肠、咸肉、火腿中方、烟熏肉的含量，结果见表5。表5表明，农家腊肠A、B和火腿中方样品中PC-OOH的含量比较高，分别为92.4、106.4 nmol/g和102.5 nmol/g，在烟熏肉中未检出PC-OOH。

表5 实际样品分析结果（n=3）Table5 C on tents of PC-OOH in real samples （n= 3）

3 结 论

本实验通过样品处理条件和色谱条件的优化，以合成的C16∶0/18∶2PC-OOH为标样，建立了腌腊肉制品中PCOOH的正相高效液相色谱-PAD检测方法。腌腊肉制品中的PC-OOH经氯仿/甲醇提取、浓缩后，在正相硅胶柱上以水、正己烷、异丙醇为流动相进行色谱分离。在20～600 nmol/mL的线性范围内，检出限、定量限分别为5.8 nmol/mL和19.4 nmol/mL，在32～240 nmol/g的添加范围内，平均回收率87.5%。对实际样品的分析检测中，农家腊肠A、B和火腿中方样品中PC-OOH的含量比较高，分别为92.4、106.4 nmoL/g和102.5 nmoL/g，烟熏肉中PCOOH的含量太低，未检出。结果表明，腌腊肉制品中普遍存在磷脂酰胆碱氢过氧化物，其形成途径、影响因素及其最终归宿值得进一步关注。本实验方法操作简便、具有良好的灵敏度和准确性，可用于腌腊肉制品中PCOOH的检测，也可用于肉制品加工过程中磷脂酰胆碱氧化途径、及其对脂质氧化贡献等相关研究。

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Determination of Phosphatidylcholine Hydroperoxide in Dry Cured Meat Products by Normal-Phase High Performance Liquid Chromatography

REN Shuang1，2，3， SONG Hui1，2， GENG Zhiming2， WANG Daoying2， ZHANG Muhan2， SUN Chong2， XU Weimin1，2，3，*
（1.Key Laboratory of Meat Processing and Quality Control， Ministry of Education， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China；2.Institute of Agricultural Products Processing， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China；3.Collaborative Innovation Center of Meat Production and Processing， Nanjing 210095， China）

A normal-phase high-performance liquid chromatographic （HPLC） method was established to determine phosphatidylcholine monohydroperoxide （PC-OOH） in dry cured meat products.The PC-OOH in dry cured meat samples was extracted with chloroform/methanol （2:1， V/V）， followed by determination by normal-phase HPLC connected to a photo-diode array detector （HPLC-PAD） with synthetic C16:0/18:2PC-OOH as the standard.The chromatographic conditions were established using a Lichrosorb Si60column （250 mm × 4.0 mm， 5 μm） with a mobile phase consisting of water and n-hexane/isopropanol （3:2， V/V） in gradient elution at a flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at 234 nm.Results indicated that the linearity ranged from 20 to 600 nmol/mL （R2= 0.999 9）， and the limits of detection （LOD）and limits of quantification （LOQ） were 5.8 nmol/mL and 19.4 nmol/mL， respectively.The recoveries from spiked samples at concentration levels of 32-240 nmol/g were in the range of 79.4%-91.9%.The contents of PC-OOH in farm-made sausage A， B and Chinese ham samples were 92.4， 106.4 and 102.5 nmol/g， respectively， while PC-OOH in smoked meat was not detected.This method proved to be of high maneuverability， excellent sensitivity and high accuracy， and could be used for quantitative analysis of PC-OOH in dry cured meat samples.

dry cured meat； 1-palmitoyl-2-linoleoyl-phosphatidylcholine； hydroperoxide； normal-phase HPLC

10.7506/spkx1002-6630-201614027

TS207.3

A

1002-6630（2016）14-0154-06

任双， 宋慧， 耿志明， 等.正相高效液相色谱法测定腌腊肉制品中磷脂酰胆碱氢过氧化物的含量［J］.食品科学， 2016，37（14）: 154-159.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614027. http://www.spkx.net.cn

REN Shuang， SONG Hui， GENG Zhiming， et al.Determination of phosphatidylcholine hydroperoxide in dry cured meat products by normal-phase high performance liquid chromatography［J］.Food Science， 2016， 37（14）: 154-159.（in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614027. http://www.spkx.net.cn

2015-10-10

国家自然科学基金青年科学基金项目（31401560）；江苏省农业科技自主创新资金项目（CX（13）3081）

任双（1990—），女，硕士研究生，研究方向为肉品加工与质量控制。E-mail：2013108049@njau.edu.cn

*通信作者：徐为民（1969—），男，研究员，博士，研究方向为肉品加工与质量控制。E-mail：weiminxu2002@aliyun.com