经典Wnt信号通路对骨代谢的调节作用

徐伟丽 牛玲玲 王文侠 崔鹏举

1. 哈尔滨工业大学化工学院食品科学系，哈尔滨 150090 2. 齐齐哈尔大学食品与生物工程学院黑龙江省普通高校农产品加工重点实验室，齐齐哈尔 161006

Wnt信号通路在各种生物中具有高度的保守性，对于细胞的分化、生长、凋亡及细胞功能的表达都有重要作用，为生物生长发育所必需。Wnt信号通路包含3条通路：经典Wnt/ β-catenin信号通路，非经典Wnt/钙离子(Wnt/Ca2+)通路和Wnt/PCP(planar cell polarity，PCP)通路。与经典通路相比，非经典通路并不依赖胞内的β-catenin，而是通过调节细胞内Ca2+浓度或细胞极性来实现其功能[1,2]。目前，人类基因研究和小鼠实验都证明Wnt信号通路在调控骨形成过程中发挥着重要作用。Wnt信号通路在骨形成中核心作用的确认，使它成为开发防治骨骼类疾病新药的非常有吸引力的目标[1]。该信号通路已成为目前骨骼系统相关疾病发病机制和骨代谢研究的新热点，现就相关报道综述如下。

1 经典Wnt信号通路的调控机理

Wnt/β-catenin通路的主要作用机制(见图1)是胞外的Wnt蛋白与膜上的受体蛋白复合物结合(由卷曲蛋白(Frizzled，Fz)和低密度脂蛋白受体相关蛋白(LDL receptor related protein，LRP5/6组成)，激活胞内的散乱蛋白(Dishevelled，Dvl)诱导胞内的四聚体(APC、Axin、GSK-3β、β-catenin)解体，从而使细胞内的β-catenin浓度升高，进入细胞核内与转录因子(T cell factor / lymphoid enhancer factor，TCF/LEF)结合，最终诱导靶基因(cyclinD1、c-myc、Runx2、Osx等)的表达。在没有Wnt蛋白存在的情况下，四聚体将β-catenin泛素化标记并最终通过泛素化途径降解，使其浓度降低而抑制靶基因的表达[3]。

图1 经典Wnt信号通路[4]Fig.1 Classic Wnt signaling[4]

2 与骨代谢相关的胞外成分—— Wnt

Wnt蛋白家族由19种分泌型富含半胱氨酸的蛋白质组成，在骨细胞形成和骨构建过程中起重要作用[5]。Wnt1类(Wnt1和Wnt3a)与经典Wnt通路相关，它通过和卷曲蛋白、LRP5/6形成复合蛋白来激活经典Wnt通路[6]。该复合体会引起GSK3β的磷酸化并导致其失活，这一过程能够抑制β-catenin的降解，促进其在细胞核中积累进而发挥作用[7]。非经典的Wnt5a类和卷曲蛋白结合，激活三联体G偶联蛋白，并且通过C依赖蛋白激酶系统或者JNK依赖的蛋白激酶来提高胞内的钙离子浓度，从而影响细胞骨架的形成[8]。

Wnts能够通过经典和非经典通路抑制成熟的成骨细胞凋亡，从而延长它的寿命[9]。Wnts也能够直接作用于破骨细胞，降低破骨细胞中的β-catenin浓度从而增加破骨细胞的数目，增加骨吸收，降低骨量[10]。最新研究发现，在早发型骨质疏松和成骨不全症患者的常染色体中，Wnt1基因发生了错义突变[11]。

由骨细胞分泌的硬骨素(Sclerostin)，能够和Wnt蛋白竞争LRP5/6在胞外的结合位点。硬骨素的缺乏，会启动Wnt信号通路，从而导致人和鼠体内的骨量急剧上升。处在失重状况下的宇航员会快速的流失大量骨质，就是由于骨细胞响应相关的机械刺激，分泌的硬骨素升高造成的[12,13,14]。甲旁腺素(parathyroid hormone，PTH)能够抑制骨细胞产生硬骨素，从而通过Wnt通路增加骨量来治疗骨质疏松，这也是目前唯一被广泛认可的治疗方案[15]。硬骨素的人源单克隆抗体—Romosozumab，能够升高骨密度(bone mineral density，BMD)并促进骨形成，减少骨重吸收。在一项针对低BMD的绝经后妇女实验中(为期1年)，Romosozumab作用组BMD的增长幅度(11.3%)比bisphosphonate alendronate(4.1%)和PTH(7.1%)都要大[16]。目前这个药物已进入三期临床试验阶段，进一步验证它对BMD的确切疗效及长期服用的副作用[17]。

3 与骨代谢相关的胞内成分

3.1 Axin

脊椎动物的两种Axin基因分别表达Axin和Axin2蛋白。两者的功能相似，但是Axin持续表达，而Axin2只有在Wnt通路激活时才表达，并且起到负反馈调节的作用；另外，Axin广泛表达，而Axin2只在特定的组织表达[18]。人类Axin2的基因突变有可能导致遗传性牙齿发育不全、直肠癌等[19]。在人胚胎早期，母体缺乏Axin会导致最初的糖原降解滞后。对S2细胞进行Axin-RNAi实验，结果表明内源性糖原水平以及GSK3β都有所升高[20]。

Axin是四合体的骨架蛋白，N末端的RSG区域和APC(adenomatous polyposis coli)结合。C末端的DIX区域和散乱蛋白的相关区域功能类似，主要促进两者间的相互作用。另外还有单独作用于β-catenin、GSK-3β和CKIa的区域以及与磷酸酶PP2A作用的区域。当Wnt蛋白与LRP5结合后，Axin就被征募到细胞膜，与LRP5的胞内区域相互作用，进而阻止Axin参与β-catenin的降解过程[21]。Wynne Peterson-Nedry等发现完全敲除果蝇Axin上APC、GSK3或β-catenin结合位点，也只是导致中度的发育迟缓，因此他们认为Axin和另外的三聚体结合，主要作用是大大提高复合体的稳定性[22]。

3.2 GSK-3β

糖原合成酶激酶-3(Glycogen synthase kinase 3，GSK-3)是一种丝氨酸(S)/苏氨酸(T)激酶，在哺乳动物中有α(51ku)和β(47ku)两种类型。GSK的酶活性受磷酸化位点的影响：GSK3β的9位和GSK3α的21位丝氨酸磷酸化是非活性形式，GSK3β的216位和GSK3α的279位酪氨酸磷酸化是活性形式[23]。GSK-3β在Wnt信号途径中通过与Axin结合磷酸化β-catenin末端的3个丝氨酸/苏氨酸(S33，S37，T41)，促进β-catenin被特定的泛素酶系统识别。Axin上也有CKIα的结合位点，其主要是通过磷酸化β-catenin的45位丝氨酸，来促进GSK-3β的磷酸化过程。在细胞内GSK3β还可以磷酸化Wnt通路的其他成分如Axin，APC等，这一作用能够增强它们与β-catenin结合的能力，并提高Axin的稳定性[24]。Dvl与Fz/LRP复合体结合后被激活，然后将GBP带入四聚体复合物，可使GSK-3β从Axin上解离，抑制β-catenin的降解[25]。

GSK3β对成骨细胞的形成和分化有重要的影响。实验表明GSK-3β的抑制剂如LiCl能够使骨质疏松的小鼠骨量增加，骨矿物质密度显著提高[26]。锂虽然被用来治疗极性功能紊乱病，但是却会造成病人骨矿化密度降低[27]，对其进一步跟踪研究表明，停止服用后有增加骨折的风险，[28]。Gregory等用GSK3β抑制剂(2’Z, 3’E)-6-bromoindirubin-3’-oxime(BIO)作用于斑马鱼(zebrafish)，发现使用GSK3β的抑制剂能够促进鱼鳍再生[29]。Sisask等将GSK3β的抑制剂AZD2858作用于股骨骨折的小鼠，作用一周后能明显增加骨痂中骨矿化密度和升高骨矿物质含量，在没有先形成软骨组织的情况下快速治愈骨折[30]。这些研究结果表明GSK3β是骨质疏松预防治疗的靶点。但是，由于GSK-3β分布广泛，而且它在多种信号通路中同时存在，与人的多种疾病如神经系统错乱、糖尿病、炎症、癌症、心力衰竭等密切相关，所以限制了它在治疗骨质疏松症中的应用[31]。

GSK-3β对破骨细胞的形成也有重要的影响，GSK3β的非活性状态对于单核巨噬细胞分化为破骨细胞尤为重要。有报道指出GSK3β的非活性形式促进了破骨细胞的形成[32]；而采用抑制上游调控因子RANKL的方式抑制GSK3β的表达，会抑制破骨细胞的形成。因此，关于GSK对于破骨细胞形成的确切作用机制还不清楚，仍需进一步研究[33]。

3.3 β-catenin

β-catenin由染色体3p21-22的CTNNbl基因编码，其N端由130个氨基酸组成，是GSK-3β的作用位点。C末端的100个氨基酸主要通过与LEF/TCF结合发挥作用。中间连接臂还有550个氨基酸[34]。β-catenin主要通过胞质中的浓度起作用。在没有Wnt存在的情况下，其一端被固定在细胞膜上，另一端与GSK-3β、APC、Axin结合，被GSK-3β磷酸化标记后，通过泛素化酶水解系统降解，保持低浓度。在Wnt存在的情况下，通路被激活，四聚体复合物解体，β-catenin降解不发生，高浓度的β-catenin进入细胞核中发挥作用[6]。

体内和体外实验均证明β-catenin是影响Runx2基因表达的重要因素，可以通过抑制间质细胞Runx2基因的表达，从而抑制间质细胞向成骨细胞的转化，促进其转化为软骨细胞[35]。Holmen等在体外实验中发现成骨细胞中β-catenin基因的缺失会导致几种骨质疏松症，并且影响成骨细胞的分化。在体内试验中，成骨细胞中该基因的缺失会导致体内由核因子κ B受体活化因子配体(Receptor Activator for Nuclear Factor-κ B Ligand，RANKL)激活的骨保护素(Osteoprotegerin，OPG)和相关受体的改变，影响破骨细胞的生成。从而在基因层面证明了破骨细胞中β-catenin的异常调节会导致骨发育不良，并证明了成骨细胞中的Wnt/β-catenin通路和破骨细胞的功能转变相关[36]。

Xu等对480位绝经后骨质疏松患者和170位正常绝经后妇女调查后发现，前者比后者血清中的β-catenin水平要低。在绝经后骨质疏松患者血清中，β-catenin与OPG正相关，跟RANKL/OPG、体重指数、硬骨素负相关。这说明绝经后骨质疏松的发病可能和血清中β-catenin浓度的降低和RANKL/OPG比率的升高有关[37]。

4 与骨代谢相关的核内因子——Runx2/Cbfa1

Runx/Cbfa/Aml/Pebp转录因子家族包含3个单独的基因。Cbfa1(Core binding factor a1)/Runx2(tunt related transcriptional factor a1) 能够决定多功能间质干细胞向成骨细胞的分化，其作用机理包括早期诱导成骨细胞的分化和后期抑制它的凋亡[38]，在成骨细胞中的分布最多(在成骨细胞中，Cbfa1和骨钙素基因、胶原蛋白Ia、骨唾液蛋白和骨桥蛋白的启动子区相结合)，在胸腺细胞和T细胞中也有表达。Cbfa1的遗传突变会严重损害人的骨形成过程，这种疾病称为颅骨锁骨发育不良综合症。小鼠体内缺乏Cbfa1基因会导致间质细胞的分化受到抑制，造成骨形成不足[39]。小鼠细胞膜和软骨细胞中如果完全缺少Cbfa1/Runx2或者不足单倍剂量的基因表达，都会导致中央轴空病(central core disease，CCD)的发生。已有证据表明，Runx2能够同Lef1或TCF构成复合体，结合在FGF18(成纤维细胞生长因子)启动子上，诱导骨发育调控因子FGF18的表达[40]。体外实验表明Runx2有多种调控作用，它能够影响碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)的活性、诱导不成熟间质干细胞中骨基质蛋白基因的表达、成骨细胞的矿化等[41]。

5 与骨代谢相关的下游调控因子

经典Wnt通路的下游调控基因有cyclinD1、c-myc、Runx2等。cyclinD1是细胞周期增殖信号的关键蛋白，主要调控细胞从G1期到S期，由β-catenin和LEF/TCF的复合体所激活[42]。c-myc基因同cyclinD1的作用类似，它能够加速细胞的周期过程，促进成骨细胞的分化增殖[43]。核内的Runx2基因是众多信号通路调整的共同靶基因，它的表达能够明显刺激成骨细胞的增殖分化[1]。

6 展望

随着人口数量的增加、社会人口老龄化的出现，骨骼类疾病，特别是原发性骨质疏松(osteoporosis，OP)已经成为老年人、尤其是老年妇女最为常见的疾病之一。由于其患病率和死亡率高，骨骼类疾病现已成为公众关注的健康问题。经典 Wnt/β-catenin通路对骨细胞的调控作用已经得到广泛的证实。该信号通路涉及骨骼类疾病、癌症等多种疾病的发生，特别是在骨骼类疾病的发病和治疗过程中扮演着重要角色，所以研究更加深入。近年来对Wnt/β-catenin通路的研究主要集中于两个方向：一是细胞核内下游靶基因的调控因子及调控路径；二是影响通路的限制因子。Wnt通路的众多组分为治疗骨质疏松提供了大量的潜在作用靶点如Dkk1，硬骨素，各调控因子的单克隆抗体等。但是整个 Wnt/β-catenin信号转导通路中细胞因子如何调节成骨细胞的具体机制并不完全明确。另外，骨骼在形成过程中除了受到经典和非经典的Wnt通路的调控作用外，还涉及ER通路、osteoprotegerin receptor activator for nuclear factor κ B ligand(OPG/RANKL)通路、BMP-2/Smads通路、丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases，MAPK)通路等的调节，它们的许多成分对细胞的作用相互重叠。这些通路之间如何联系，仍未阐明。所以，除了各个通路成分单独作用的效果外，该成分对其他通路的作用将成为另一个研究的热点。