辅酶Q10对10月龄小鼠股骨的Micro CT观察及骨生物力学检测

黄志荣 朱丽斌 吴海游 陈丽思 吕思敏 许碧莲 崔燎 邹丽宜* 吴铁,,*

1. 广东医学院药学院， 东莞 5238082 2. 广东天然药物研究与开发重点实验室， 湛江 5240233 3. 广东医学院广东润和生物科技有限公司辅酶Q10联合研究中心， 东莞 523808

辅酶Q10(coenzymeQ10, Co Q10)属于脂溶性醌类化合物，广泛存在于所有的生物膜中，参与到呼吸链电子传递、抗氧化、代谢调节、细胞分化调节等过程中，同时辅酶Q10是一种具有强大的清除自由基作用的抗氧化剂[1]。本课题组之前已经[2]在30 mg·kg-1·d-1这一个剂量探究过Co Q10对环磷酰胺模型的大鼠股骨的显微结构的改变，对骨量有一定的改善作用。维生素E(vitamin E, VE)是高效的抗氧化剂和自由基清除剂，维生素E与Co Q10都是抗氧化剂，本课题组[3]已经证明250mg/kg这一个剂量能有效预防衰老小鼠的骨丢失，因此以VE作为阳性对照药。这次我们采用不同大剂量的Co Q10，同时以8月龄的小鼠作为研究对象，探究不同大剂量Co Q10对小鼠股骨的显微结构的影响，并与维生素E(vitamin E, VE)联合应用进行对比，为Co Q10抗骨质疏松的进一步研究提供依据。

1 材料与方法

1.1实验动物

35只SPF级8月龄雌性KM小鼠，由南方医学大学实验动物中心提供，体重(45.51±4.67)g，动物合格证：SCXK(粤)2011-0015。

1.2药品与试剂

辅酶Q10(药用原料药)：由广东润和生物科技有限公司提供，少量的大豆卵磷脂(北京索莱宝科技有限公司，批号：714B023)作为表面活性剂，先让其溶解在黑芝麻油(平舆康博汇鑫油脂有限公司)中，之后将2 500 mg和5 000 mg的辅酶Q10分别添加到50ml卵磷脂黑芝麻油中搅拌溶解即可得；维生素E软胶囊(广州白云山星群(药业)股份有限公司，批号：LE40017)；生理盐水(东莞市普济药业有限公司，批号：14082501);Micro CT仪(viva CT40; SCANCO Medical AG);Mini Bionix型材料测试系统(MTS; USA)。

1.3实验动物与分组

8月龄KM小鼠35只，适应性饲养2周后，按体重对等原则随机分为5组，每组7只。A组为正常对照(CON)组，该组小鼠每天灌胃给予生理盐水10 ml/(kg·d);B组为维生素E(VE)组，该组小鼠每天灌胃给予VE250 mg/(kg·d)；C组辅酶Q10(Co Q10L)低剂量组，该组小鼠每天灌胃给予Co Q10500 mg/(kg· d)；D组辅酶Q10(Co Q10H)高剂量组，该组小鼠每天灌胃给予Co Q101 000 mg/(kg·d)。E组辅酶Q10(Co Q10L)低剂量联合维生素E(VE)组，该组小鼠每天灌胃给予Co Q10500 mg/(kg·d)和VE250 mg/(kg·d)。5组动物均自由饮水和进食。实验共给药10周，每隔1周称取体重1次，实验结束时，取右侧股骨进行Micro-CT扫描和三维重建，取左侧股骨进行生物力学检测。

1.4骨生物力学检测

检测时，将-20℃保存的股骨常温解冻，生理盐水复湿。用858 Mini Bionix型材料测试系统监测和分析小鼠左侧股骨的生物力学性能。将股骨置于流变仪上分别进行三点弯曲实验，加载速度为0.155mm/s，跨距 9mm。由载荷、桡度换算并绘制应力-应变曲线，从曲线上读取及根据公式计算相应的指标：最大载荷(Maximum load)、最大位移(Maximum displacement)、弹性载荷(Elastic load)、弹性位移(Elastic displacement)、刚度(Stiffness)等。

1.5Micro-CT测量

将处理好的小鼠股骨放入Micro-CT仪，对股骨的近干骺段进行X射线扫描。扫描条件为：图像矩阵为2048×2048,整合时间为200 ms，能量/强度为70 kVp、114 μA、8 W。以0°旋转，进行扫描。扫描完成后，选取生长板远端1.0 mm、层厚2.0 mm的骨组织为松质骨感兴趣区域(region of interest，ROI)进行三维重组，最低阈值为160提取图像信息。获取重组图像后，使用Micro-CT自带的软件进行定量分析。物理参数分析如下：骨密度(bone mineral density, BMD)、连接密度(connection density, Conn.D)、骨体积分数(bone volume/total volume, BV/TV)、结构模型指数(structure model index, SMI)、骨小梁数量(trabecular number, Tb.N)、骨小梁分离度(trabecular separation, Tb.Sp)、骨小梁厚度(trabecular thickness, Tb.Th)。

1.6数据处理

2 结果

2.1各组小鼠实验前及实验后的体重变化

如表所示，与CON组相比， Co Q10L、Co Q10H、VE组小鼠和Co Q10L联合VE组的体重差异无显著意义(P>0.05)，提示Co Q10和VE对小鼠的体重影响不大。

表1 各组小鼠实验前及实验后的体重变化Table 1 Changes of body weight in mice of different groups n=7)

注：CON为正常组、VE为维生素E组、Co Q10L为辅酶Q10低剂量组、Co Q10H为辅酶Q10高剂量组、Co Q10L+VE为辅酶Q10低剂量联合维生素E组。

2.2各组小鼠股骨远端松质骨Micro-CT定量参数的变化与CON组比较，Co Q10L组BV/TV明显上升112.4%(P<0.05),连接密度明显上升175.8%(P<0.01),骨密度BMD明显上升112.45%(P<0.01),SMI明显下降34.21%(P<0.01),但是Tb.N,Tb.Sp,Tb.Th没有明显变化。与CON组比较，Co Q10H组BV/TV上升75%,连接密度明显上升200.3%(P<0.01),骨密度BMD上升76.9%(P>0.05),SMI明显下降30.52%(P<0.05),同时Tb.N,Tb.Sp,Tb.Th没有明显变化。

与CON组比较，VE组BV/TV没有明显的变化,连接密度明显上升158.8%(P<0.01),骨密度BMD明显上升82.8%(P<0.01),SMI明显下降36.84%(P<0.01)但是Tb.N,Tb.Sp,Tb.Th没有明显变化。Co Q10L组、Co Q10H组与分别与VE组比较，两组间的参数均没有统计学差异(P>0.05)。

与CON组比较，Co Q10L联合VE组BV/TV上升了54.9%(P>0.05),连接密度明显上升162.7%(P<0.01),骨密度BMD上升54.9%(P>0.05),但是SMI,Tb.N,Tb.Sp,Tb.Th没有明显变化。Co Q10L+VE组分别与VE组、Co Q10L组、Co Q10H比较，两组间的参数均没有统计学差异(P>0.05)。见表 2。

表2 Micro CT测定的小鼠股骨骨密度，骨体积分数，连接密度，数量，分离度和厚度参数Table 2 Changes of microstructural parameters of distal femur in mice of different

*P<0.05,**P<0.01,vs CON 注：CON为正常组、VE为维生素E组、Co Q10L为辅酶Q10低剂量组、Co Q10H为辅酶Q10高剂量组、Co Q10L+VE为辅酶Q10低剂量联合维生素E组。

2.3各组小鼠股骨远端松质骨Micro-CT二维图和三维图

与CON组(图1-A)比较，Co Q10L(图1-C)骨小梁走向一致，结构紧密，区域出现更为明显的网状结构，保持完整的微观构筑。同时Co Q10低剂量与VE组(图1-B)较CON组要完整，主要表现为骨小梁增多，间隙变小，排列有序出现较多完整的骨小梁连接结构。Co Q10高剂量组(图1-D)出现部分的网状结构，但是较Co Q10低剂量组(图1-C)要稀疏。Co Q10L+VE(图1-E)组骨小梁数目稀疏，间隙变大。见图1。

2.4各组小鼠股骨生物力学参数变化

与CON组比较，Co Q10L组的刚度明显上升21.86%(P<0.05), 最大载荷上升27.23%(P>0.05)，说明Co Q10L组股骨韧性增加，脆性减弱，抗变形能力有所增强。与CON组比较，Co Q10H组的最大位移明显上升46.67%(P<0.05)，但是弹性载荷明显下降18.32%(P<0.05)。

图1 各组小鼠远端股骨的显微结构图Fig.1 Micrographs of the vertical section of distal femur in different groups of miceNote: A:CON; B:VE; C:Co Q10L; D:Co Q10H; E: Co Q10L+VE

图2 各组小鼠远端股骨的SEG三维重建图注：图2为SEG图，反映骨小梁的数量Fig.2 Segmented(SEG) image ofmicro-CT of distal femur in mice in different groupsNote: A:CON; B:VE; C:Co Q10L; D:Co Q10H; E: Co Q10L+VE

图3 各组小鼠远端股骨的分离度的三维重建图注：图3为SP图，反映骨小梁的分离度情况，从绿到红，反映了骨分离度从小到大Fig.3 Trabecular separation image ofmicro-CT of distal femur in mice in different groupsNote: A:CON; B:VE; C:Co Q10L; D:Co Q10H; E: Co Q10L+VE

图4 各组小鼠远端股骨的厚度的三维重建图注：图4为TH图，反映骨小梁的厚度分布情况，从绿到红，反映了骨从薄到厚。Fig.4 Trabecular thickness image of micro-CT of distal femur in mice in different groupsNote: A:CON; B:VE; C:Co Q10L; D:Co Q10H; E: Co Q10L+VE

与CON组比较，VE组最大载荷、最大位移、弹性载荷、刚度有所上升，但变化没有显著性差别。Co Q10L组与VE组之间变化没有差别。与CON组比较，Co Q10L联合VE组没有统计学差异(P>0.05)。见表3。

3 讨论

骨生物力学主要是研究骨组织在外界作用下的力学性能和骨在受力后的所产生的生物学效应，是评价药物对骨质量的指标，骨量的减少以及骨质内部结构的改变均能影响骨生物力学，可降低生物力学强度[4]。另外，Micro-CT通过X线扫描和三维重建，极大地解决了骨组织形态计量学测量方面存在切片方向的不固定性和二维平面的局限性的问题，成为研究分析骨微观结构的新兴技术，是理想的研究骨形态学的工具[5]。从小鼠股骨二维纵切面截图和三维结构重建后的分割图直接观察骨小梁的结构形态，纵切面截图能够直观表现骨小梁的结构形态，骨小梁分离度图可反映骨小梁的距离情况，从绿到红，反映了骨小梁之间的距离越来越大。骨小梁厚度图除了可见骨小梁的结构和几何信息外，还可接反映骨小梁的厚度分布情况，从绿到红，反映了骨从薄到厚，给骨骼的结构参数及力学参数的定量数值，观察骨微结构变化[6]。

表3 各组小鼠股骨的最大载荷，最大位移，弹性载荷，弹性位移，刚度Table 3 Changes of biomechanical peoperties of femur in mice of different

*P<0.05 vs CON 注：CON为正常组、VE为维生素E组、Co Q10L为辅酶Q10低剂量组、Co Q10H为辅酶Q10高剂量组、Co Q10L+VE为辅酶Q10低剂量联合维生素E组。

3.1辅酶Q10对10月龄小鼠股骨显微结构和生物力学的影响

由表2和表3结果可知，Co Q10对10月龄小鼠股骨的显微结构有一定的改善作用。与CON组相比，Co Q10L组的刚度明显增加，刚度反映抗变形能力，说明Co Q10L能增加小鼠股骨抗变形能力。另外，Co Q10L组SMI明显下降，BV/TV、BMD和Conn.D明显升高。SMI 是用于评价骨小梁的形态结构，定义骨小梁板状和杆状的程度，理想板状结构为0，理想杆状结构为3，发生骨质疏松时，骨小梁从板状向杆状转变，SMI数值增加，说明Co Q10L组骨小梁结构有所改善。Co Q10L组能明显增加BV/TV，BV/TV是描述松质骨结构的一个参数，能够反映松质骨样本内骨组织体积的含量，提示Co Q10L能提高小鼠股骨的骨体积分数。Co Q10L组BMD和Conn.D明显升高，BMD和Conn.D分别描述骨密度和连接密度，说明Co Q10L能明显增加小鼠股骨骨密度，并使其结构相对紧密。Tb.Th、Tb.N和Tb.Sp分别描述厚度、骨小梁数目和分离度这三方面，虽然Co Q10L组这三个参数没有明显的统计学差异，但是Tb.Th、Tb.N有所上升和Tb.Sp有所下降。Co Q10L组BV/TV、BMD和Conn.D明显升高说明辅酶Q10可能通过调节核因子-κB(RANKL)诱导的破骨细胞分化过程，从而抑制破骨细胞的活性[7]，破骨细胞吸收能力小于成骨细胞骨形成功能，使得吸收范围减少，进而使其连接密度、骨小梁数目和骨体积增多，小鼠股骨松质骨网状结构的完整性得以保存，这与生物力学的参数结果相符合，表明松质骨微结构的改变影响了骨承载能力，对生物力学性能产生影响。

与CON组相比，Co Q10H组弹性载荷和最大位移明显增加，提示Co Q10H能够改善小鼠股骨的韧性。另外，Co Q10H组BV/TV、SMI和Conn.D明显上升，但是在Tb.Th和Tb.N并没有改变，说明骨体积、骨结构和连接密度虽然有明显的提高，但是骨小梁数目和骨的厚度并没有提高，从而只是使股骨结构的韧性得到提高，提示了使用过高剂量的辅酶 Q10并不能改善小鼠股骨的显微结构和骨生物力学，因为Co Q10在破骨细胞的生成的过程中会抑制抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、NFATc1的基因表达以及相关免疫球蛋白样受体而使破细胞活性减低，但是其作用有与Co Q10的剂量呈一定的剂量相关性，在一定的浓度范围内才会使破骨细胞活性减低[7]。这提示了过大剂量的Co Q10并不能改善小鼠的骨微结构和生物力学性能，要在合适的剂量范围内才会产生作用，这也说明了之前我们课题组30 mg·kg-1·d-1Co Q10这一剂量太小，导致环磷酰胺模型的大鼠股骨的显微结构和骨量只有一定的改善作用，并没有很好的提高其骨密度和生物力学性能。

3.2维生素E对10月龄小鼠股骨显微结构和生物力学的影响

维生素E是高效的抗氧化剂和自由基清除剂，它主要通过抗氧化清除自由基，减少成骨细胞的氧化倾向同时刺激成骨细胞的活性，从而促进骨健康[8-9]。由表2中可得，与CON组比较，VE组小鼠股骨的部分参数有所修复，BMD和Conn.D明显增加，BV/TV有上升的趋势，Tb.Th、Tb.N和Tb.Sp没有明显的统计学差异，这提示维生素E可能在Tb.Th、Tb.N和Tb.Sp三个方面的共同作用下使BMD增加。

3.3辅酶Q10低剂量联合维生素E对10月龄小鼠股骨显微结构和生物力学的影响

与CON组比较，由表2和表3结果可知，Co Q10L联合VE组只有Conn.D明显升高，其他参数并没有太大的变化，生物力学方面参数没有统计学差异。说明Co Q10L联合VE组对小鼠股骨的显微结构和骨生物力学改善作用有限，这同时说明了单一应用Co Q10或者VE都能一定的改善小鼠股骨的显微结构和骨生物力学参数，但是联合应用在一起却没有很好的效果，其中的原因可能是药物的协同作用所致，有研究[10]指出在抗氧化的过程中Co Q10和VE有协同作用，Co Q10通过还原VE在清除自由基是产生的α-生育酚酰基自由基，节约和再生VE，但是其中Co Q10和VE剂量大小的配伍，却有待进一步的探讨，同时说明了Co Q10L联合VE组的剂量并不是合适的浓度。VE主要的机制是通过抗氧化清除自由基，减少成骨细胞的氧化倾向同时刺激成骨细胞的活性，从而促进骨健康。同时有文献报道，辅酶Q10减少活性自由基表达的同时，抑制破骨细胞的形成，促进成骨细胞矿化[11]，这提示了辅酶Q10可参与调节骨代谢的过程，抑制骨质疏松的发生。近几年来有文献报道辅酶Q10有改善骨关节炎和骨退化的作用，其机制可能是通过调节一氧化氮和炎症细胞因子[12]，因此Co Q10主要通过抑制破骨细胞的表达，两者的作用机制不一样，对骨的影响也是在不同的方面。

3.4小结

综上所述，本实验研究了500 mg/(kg·d)Co Q10在预防小鼠骨质疏松中的作用效果，已表现出了良好的效果，特别是其改善骨质量，增加骨生物力学性能的作用。这一现象提示Co Q10在抗骨疏松方面具有良好的应用前景，但是其具体的作用机制有待进一步的探究。