嗅鞘细胞联合神经干细胞对大鼠急性脊髓损伤及脑源性神经营养因子表达的影响*

陈大伟刘燕青张朝

嗅鞘细胞联合神经干细胞对大鼠急性脊髓损伤及脑源性神经营养因子表达的影响*

陈大伟①刘燕青①张朝①

【摘要】目的：探讨嗅鞘细胞（OECs）联合神经干细胞（NSCs）对大鼠急性脊髓损伤及脑源性神经营养因子（Brain Derived Neurotrophic Factor，BDNF）表达的影响。方法：取新生3 d SD大鼠的海马和嗅球制备神经干细胞和嗅鞘细胞，对80只SD大鼠做急性脊髓损伤造模，随机分为对照组（假手术组）、NSCs移植组、OECs移植组、NSCs+OECs联合移植组（记为实验A、B、C组），细胞移植。于术前，术后1、3、7、14、21 d行BBB评分、斜板实验和运动诱发电位（MEP N1波）潜伏期检测，在各组随机抽一只SD大鼠做免疫组化，观察比较受损脊髓中BDNF的表达情况。结果：（1）BBB评分变化：除第1天外，各实验组恢复程度均明显大于对照组（P＜0.05），第7天开始各实验组间两两比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。（2）斜板试验角度变化：第1周开始，四组中任意两组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。（3）MEP（N1波）潜伏期变化：自第3天，四组中任意两组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。（4）BDNF染色阳性细胞数变化：细胞移植后，各组大鼠受损脊髓中BDNF开始升高，第3天到高峰后减少。术后第3天开始，四组中任意两组比较均有统计学意义（P＜0.05）。结论：采用细胞移植治疗大鼠急性脊髓损伤，OECs与NSCs联合移植治疗效果最佳；单细胞移植时，OECs比NSCs移植治疗效果更强。联合移植组中BDNF表达最高。

【关键词】嗅鞘细胞； 神经干细胞； 急性脊髓损伤； 脑源性神经营养因子

First-author’s address：The First Affiliated Hospital of Baotou Medical College，Baotou 014010，China

脊髓损伤（Spinal Cord Injury，SCI）是临床上中枢神经系统一种严重的创伤性疾病。该病有发病率高，致残率高，治疗费用高等特点，一直被医学界高度关注。仅北京地区脊髓损伤发病率就从上世纪80年代末6.8/百万人增至2002年的60/百万人，十多年间发病率增长近10倍［1］。

急性脊髓损伤动物实验中新方法和临床中治疗措施是层出不穷，细胞移植是一非常有前途的修复策略。本实验对大鼠急性损伤脊髓局部注入神经干细胞，嗅鞘细胞，神经干细胞+嗅鞘细胞，通过BBB评分、斜板实验、运动诱发电位（MEP）及免疫组化检测BDNF表达情况，来评判各组受损脊髓恢复情况，比较两种细胞各自、联合对急性脊髓损伤修复的能力，以期可作为临床治疗的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 SD大鼠88只，成年SD大鼠85只（80只实验，5只备用）；另3只（出生3 d）SD大鼠为神经干细胞和嗅鞘细胞取材。随机分组（每组20只）：对照组（假手术组）、NSCs移植组、OECs移植组、NSCs+OECs联合移植组（分别记为实验A、B、C组）。

1.2 试剂与仪器 兔抗鼠巢蛋白（Nestin）单抗、兔抗鼠P75单抗、异硫氰酸荧光素（FITC）标记羊抗兔二抗、兔抗大鼠BDNF多克隆抗体、免疫组化SABC试剂盒、生物素标记羊抗兔IgG二抗等试剂、IX71型倒置荧光显微镜、Thermo3110型5%CO2培养箱、TGL-16B型普通台式离心机等。

1.3 实验方法

1.3.1 新生SD大鼠海马和嗅球的取材 将（出生3 d）SD大鼠消毒后，引颈脱位法处死，无菌操作显露两大脑半球、嗅球和小脑。完全剥离海马，分离嗅球保持两侧嗅鞘完整。去除表面毛细血管等软组织，4 ℃下分别清洗后备用。

1.3.2 细胞培养及鉴定

1.3.2.1 嗅鞘细胞的培养及鉴定 将嗅球入DMEM/ F12培养液，剪碎吹打分离，细胞筛网过滤后离心沉淀，沉淀入DMEM/F12细胞培养液（按比例配入bFGF、EGF和B27），至培养箱（37 ℃、5%CO2）。每3天全换一次培养液，16 d传代1次。第二代细胞悬液入凹玻片，培养、弃液，PBS漂洗，固定，依步骤进行至滴兔抗鼠P75一抗（1∶200），PBS漂洗3次，滴羊抗兔二抗（1∶400），孵育封片。倒置荧光显微镜下观察。

1.3.2.2 神经干细胞的培养及鉴定 将海马同法制备，每2～4天换半量培养液，传代1次约6～8 d。鉴定同样，兔抗鼠Nestin为一抗（1∶100），羊抗兔二抗（1∶200）。封片观察。

1.3.3 大鼠急性脊髓损伤Allen’s模型的制备及局部注射细胞移植 将大鼠麻醉见效，俯卧固定，术区备皮消毒，脊正中切口（约3 cm），显露T10～12棘突及椎板。定位切除T12棘突及椎板上半部分，T11全椎板和棘突，T10棘突及椎板下半部分［2］，显露T11相应脊髓节段的硬脊膜，定为损伤区。自制改良Allen’s撞击器重物15 g高度6 cm自由落下，瞬间下落能量对T11段脊髓致伤即制为大鼠急性脊髓损伤实验模型［3］，打击后重物停3 min，硬脊膜静脉充血增粗，局部紫红色，鼠尾痉挛摆动，后肢回缩抽动，即打击有效。造模后即行细胞移植（生理盐水植入对照组、NSCs植入实验A组、OECs植入实验B组、NSCs与OECs混合1∶1植入实验C组）：用1 mL无菌注射器慢注入0.1 mL细胞悬液（数量约为1×105个）。逐层关闭伤口。术后禁食水数小时。1.3.4 功能检测 在术后1、3、7、14 d和21 d，随机抽取对照组、实验组各15只大鼠，进行BBB评分，评分基本内容：双后肢可活动的关节数量、活动范围、步态、负重、前后肢协调性及尾部活动情况，共22个分数级别；斜板实验［4］，实验时将大鼠头朝前，身体躯干与斜板平行，角度渐大，大鼠在板上停留5 s且不滑落，记录角度，测3次取平均值。两检测法对大鼠后肢运动功能进行双盲法评分来了解受损脊髓功能恢复情况；再行神经电生理运动诱发电位（motor evoked potentials，MEP）潜伏期检测，刺激电极穿骨膜置于皮层，记录电极置于暴露的坐骨神经，参考电极位于大鼠硬腭下。观察脊髓传导或外周运动神经功能状况。

1.3.5 大鼠灌注、取材、固定与免疫组化 每组随机抽一只大鼠麻醉开胸，用静脉针头经左心室入主动脉，待冰盐水从右心耳流出后灌注4%多聚甲醛。切取T10～12对应脊髓节段（损伤处为中心约1 cm），入10%福尔马林固定，脱水沉底后石蜡包埋，厚度10 μm连续切片。按SABC试剂盒操作说明进行。按步骤进行，其中按步滴入一抗兔抗鼠BDNF多克隆抗体（1∶200）、生物素化标记的二抗羊抗兔IgG。封片选最优切片15张。10倍光镜下分别计数4个视野内BDNF染色阳性细胞占总计数细胞比例，即为阳性细胞标记指数，染色阳性标志是细胞浆或细胞膜呈明显棕黄色。即检测BDNF在受损脊髓中表达情况。

1.4 统计学处理 实验结果采用SPSS 17.0软件处理，计量资料以 （±s）表示，比较采用单因素方差分析（ANOVA），P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SD大鼠急性脊髓损伤细胞移植后BBB评分变化 除第1天外，各实验组恢复程度均明显大于对照组（P＜0.05），第7天开始各实验组间两两比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1、图1。

图1 SD大鼠急性脊髓损伤细胞移植后BBB评分变化

2.2 SD大鼠急性脊髓损伤细胞移植后斜板实验角度变化 第1周开始，四组中任意两组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表2、图2。

图2 SD大鼠急性脊髓损伤细胞移植后斜板试验角度变化

2.3 SD大鼠急性脊髓损伤细胞移植MEP（N1波）潜伏期变化 自第3天，四组中任意两组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表3、图3。

图3 SD大鼠急性脊髓损伤细胞移植MEP（N1波）潜伏期变化

2.4 SD大鼠急性脊髓损伤细胞移植后BDNF染色表达阳性的细胞数变化 细胞移植后，各组大鼠受损脊髓中BDNF开始升高，第3天到高峰后减少。术后第3天开始，四组中任意两组比较均有统计学意义（P＜0.05）。见表4、图4。

图4 SD大鼠急性脊髓损伤细胞移植后BDNF染色表达阳性细胞数变化

表1 SD大鼠急性脊髓损伤细胞移植后BBB评分变化（±s） 分

表1 SD大鼠急性脊髓损伤细胞移植后BBB评分变化（±s） 分

*与对照组比较，P＜0.05；△与实验A组比较，P＜0.05；#与实验B组比较，P＜0.05

组别 1 d 3 d 7 d 14 d 21 d对照组（n=15） 0.00±0.00 0.51±0.22 2.64±0.38 5.05±0.62 5.92±0.92实验A组（n=15） 0.00±0.00 0.88±0.31*3.03±0.43*6.03±0.49*7.68±0.97*实验B组（n=15） 0.00±0.00 0.83±0.29*3.33±0.37*△6.49±0.42*△8.94±0.99*△实验C组（n=15） 0.00±0.00 0.98±0.03*3.64±0.41*△#6.87±0.43*△#9.67±0.93*△#F值 - 10.790 17.230 37.570 44.550 P值 - 0.000 0.000 0.000 0.000

表2 SD大鼠急性脊髓损伤细胞移植后斜板试验角度变化（±s）

表2 SD大鼠急性脊髓损伤细胞移植后斜板试验角度变化（±s）

*与对照组比较，P＜0.05；△与实验A组比较，P＜0.05；#与实验B组比较，P＜0.05

组别 1 d 3 d 7 d 14 d 21 d对照组（n=15） 12.93±1.26 13.25±1.21 17.12±2.56 24.17±4.52 30.19±2.36实验A组（n=15） 12.61±0.93*13.59±1.90 23.37±2.71*31.93±4.79*34.03±2.65*实验B组（n=15） 12.67±1.21*13.65±1.58 28.63±2.68*△36.69±3.86*△40.09±5.88*△实验C组（n=15） 12.62±1.31*14.62±1.57 31.07±2.79*△#41.63±6.51*△#43.52±5.95*△#F值 0.241 2.072 79.520 32.930 25.980 P值 0.867 0.114 0.000 0.000 0.000

表3 SD大鼠急性脊髓损伤细胞移植MEP（N1波）潜伏期变化（±s） ms

表3 SD大鼠急性脊髓损伤细胞移植MEP（N1波）潜伏期变化（±s） ms

*与对照组比较，P＜0.05；△与实验A组比较，P＜0.05；#与实验B组比较，P＜0.05

组别 1 d 3 d 7 d 14 d 21 d对照组（n=15） 26.28±3.32 18.51±0.99 15.83±0.71 13.57±0.96 11.59±0.97实验A组（n=15） 25.69±3.20 16.33±0.96*13.91±1.18*11.58±0.98*9.78±0.93*△实验B组（n=15） 25.10±3.48 17.11±0.93*△13.15±0.83*△10.63±0.97*△9.21±0.96*△实验C组（n=15） 25.00±3.28 17.47±0.91*△#12.24±0.79*△#9.92±0.89*△#8.61±0.95*△#F值 1.403 13.670 43.540 41.620 27.380 P值 0.252 0.002 0.000 0.000 0.000

表4 SD大鼠急性脊髓损伤细胞移植后BDNF染色表达阳性细胞数变化（±s） %

表4 SD大鼠急性脊髓损伤细胞移植后BDNF染色表达阳性细胞数变化（±s） %

*与对照组比较，P＜0.05；△与实验A组比较，P＜0.05；#与实验B组比较，P＜0.05注：表中各组例数为切片数

组别 1 d 3 d 7 d 14 d 21 d对照组（n=15） 12.76±2.63 15.59±0.81 15.21±0.98 14.33±0.99 13.95±1.04实验A组（n=15） 13.40±2.69 16.21±0.93*16.16±0.93*15.57±0.91*15.01±1.05*实验B组（n=15） 14.57±2.93 17.63±0.82*△17.15±0.94*△16.93±0.95*△16.31±0.98*△实验C组（n=15） 15.28±2.92 18.10±0.78*△#17.95±0.95*△#17.58±0.91*△#17.02±0.91*△#F值 2.470 33.609 23.534 35.566 28.133 P值 0.071 0.000 0.000 0.000 0.000

3 讨论

3.1 造模方法及脊髓损伤治疗方法的选择 实验中改良Allen’s重物打击挫伤法，不仅减小重物致伤力量延长挤压时间，还有稳定、简便、可重复性等优势，且实验中对脊髓阶段（T11）制损并未发生硬脊膜破损及脑脊液外渗等现象，与临床急性脊髓损伤更为相近，更贴切体现治疗方法及疗效对比。细胞移植在临床中对ASCI治疗国外已有报道，国内学者将嗅鞘细胞移植治疗SCI处于临床试验，效果颇为满意［5］，有望推广。NSCs有多向性分化能力，OECs可调节受损脊髓局部微环境。将NSCs和OECs分别、联合移植到急性受损脊髓中发挥各自特性，观察比较效果，来体现对受损脊髓功能恢复的强弱。

3.2 各项实验结果分析

3.2.1 BBB评分和斜板实验结果分析 BBB评分法侧重双后肢运动的各行为细节，如关节、脚趾、尾部等，斜板实验注重双后肢肌力情况，两评法从不同角度分析对比，各有侧重又有弥补，评价更加客观。

实验中各组大鼠造模前BBB评分均21分，造模细胞移植后24 h全是0分，随实验进行有不同程度恢复，各实验组比对照组明显增高（P＜0.05），说明细胞移植对急性脊髓损伤有修复作用，且大于脊髓损伤后自身恢复作用。NSCs+OECs组比OECs组、NSCs组的增高差异都有统计学意义（P＜0.05），也说明NSCs+OECs联合移植对急性脊髓损伤后运动功能发挥最大恢复作用。这与损伤早期进行联合移植会有较好效果的研究假设相符合［6］。

造模前，各组大鼠斜板实验平均角度（81.50±2.33）°，造模细胞移植后，第1天斜板实验角度降至（12.71±1.19）°，降低幅度之大与脊髓损伤导致后肢肌力减退呈直接关系，说明急性脊髓损伤造模成功。随实验进行各组斜板实验角度都回复增大，第7天开始实验组比对照组增大幅度更明显（P＜0.05），NSCs+OECs组比OECs组、NSCs组增大幅度有统计学意义（P＜0.05），OECs组次之，NSCs组最弱，再次证实单种或多种细胞移植对损伤脊髓均有不同程度修复且急性脊髓损伤后有一定自身恢复性。

3.2.2 运动诱发电位（MEP）检测结果分析 采用MEP（N1波）潜伏期为检测标准，反复刺激取平均值。造模细胞移植后各组大鼠MEP（N1波）潜伏期明显延长，对照组潜伏期延长幅度比三实验组都大，第3天开始三实验组缩短幅度大于对照组缩短幅度（P＜0.05），说明细胞移植促进受损脊髓的运动传导功能，NSCs+OECs组缩短幅度比OECs组、NSCs组都大（P＜0.05），OECs组次之，NSCs组最差，与BBB评分和斜板实验结果趋于一致。表明大鼠急性脊髓损伤后有些许修复作用，细胞移植促进修复效果应是由NSCs、OECs对轴突再生的促进，再髓鞘化及延长，建立新突触连接有助于传导束功能恢复。

3.2.3 BDNF染色表达阳性细胞数结果分析 实验观察发现，急性脊髓损伤后BDNF表达明显增大，术后第3天到高峰，后下降，说明大鼠脊髓受损早期会自我保护性的提高BDNF分泌，那么BDNF很可能参与损伤早期有限的恢复过程。三实验组BDNF表达量比对照组的增多部分，在第3、7、14、21天比较差异均有统计意义（P＜0.05）。无论BDNF上升或下降，三实验组与对照组的变化趋势相一致基础上且表达要高，说明细胞移植对BDNF表达有明显促进。OECs+NSCs组与OECs组、NSCs组相比增大很明显（P＜0.05），说明OECs+NSCs组产生BDNF最多，除OECs+NSCs分泌BDNF外脊髓损伤后自身也分泌，OECs组比NSCs组所表达BDNF要多（P＜0.05），实验组中NSCs组表达BDNF最弱，OECs组较强，OECs+NSCs组最强。

OECs、NSCs移植可提高BDNF表达，且BDNF参与ASCI修复过程，作用机制可能降低继发性损伤的炎症反应，与神经生长抑制因子进行对抗及竞争，在ASCI中对受损神经元起改善和修复的生物效应及抗损伤性的保护作用，促进轴突塑造，引导干细胞分裂方向，减少自由基代谢及堆积［7-8］，以调控到满足神经元再生所需微环境，促进脊髓损伤后功能恢复。

3.3 NSCs与OECs移植修复ASCI 目前细胞联合移植治疗ASCI倍受关注，但目前NSCs和OECs移植后各自所发挥作用机制的诸多方面并未彻底明确，结合细胞特性、以往经验和实验结果做出推测：急性脊髓损伤势必引起神经细胞衰亡、神经元残缺和坏死、纤维受损及髓鞘脱离。NSCs分化成新的神经元发挥作用；也可生成胶质细胞（如星形、少突胶质细胞等），发挥支持、滋养、协助神经信号传递。NSCs增殖分化状态受局部微环境和多种细胞因子所影响［9-11］，即NSCs对损伤脊髓发挥作用过程受干预性很强，这可能是本实验OECs组比NSCs组效果显著的原因。OECs是一种具备神经再生功能的细胞发挥作用同时分泌BDNF、NTF等神经营养因子，调节局部微环境更适宜神经细胞生长、分化及修复；还能分泌有利于神经纤维延伸的各种蛋白［12］，和在细胞膜上表达出多细胞黏合和轴突生长相关支持因子［13-14］，以建立新髓鞘，向受损边延伸，建立新突触连接。实验中OECs组大鼠双后肢运动功能和MEP（N1波）潜伏期部分恢复正是机制的体现。目前对NSCs和OECs移植后各自所发挥作用机制的诸多方面并未彻底明确，两者各自浓度和配比比例等诸多因素都需深入探索研究。在单细胞移植的基础上，医学界对联合移植治疗的研究日益升温，使之早日在脊髓损伤的综合多种方法这一链条中发挥自身最大能力。

参考文献

［1］李建军，周红俊，洪毅，等，2002年北京市脊髓损伤发病率调查［J］.中国康复理论与实践，2004，10（7）：412-413.

［2］卢旻鹏，权正学，刘渤，等.小鼠脊髓损伤标准化重物打击模型的制备及评价［J］.中国修复重建外科杂志，2008，22 （8）：933-938.

［3］ Fujimoto T，Nakamura T，Ikeda T，et al.Potent protective effects of melatonin on experimental spinal cord injury［J］.Spine，2000，25（7）：769-775.

［4］ Albert T，Ravaud J F.Tetrafigap group.Rehabilitation of spinal cord injury in France： a nationwide multicentre study of incidence and regional disparitics［J］.Spinal Cord，2005，43（6）：357-365.

［5］黄红云，王洪美，陈琳，等.嗅鞘细胞移植治疗晚期脊髓损伤临床试验初步报告［J］.立体定向和功能性神经外科杂志，2004，17（6）：348-350.

［6］ Ao Q，Wang A J，Chen G Q，et al.Combined transplantation of neural stem cells and olfactory ensheathing cells for the repair of spinal cord injuries［J］.Med Hypotheses，2007，69（6）：1234-1237.

［7］张任飞，肖诗柔.神经营养素家族类细胞因子对神经干细胞分化影响的研究现状［J］.中国科技信息，2011，21（2）：176-178.

［8］林双竹，杨璐璐，陈稳根，等.神经干细胞与脑源性神经生长因子［J］.中国医药指南，2011，11（15）：78-80.

［9］ Rogister B， Ben-Hur T， Dubois-Dalcq M. From neural stem cells to myelinating oligodendrocytes［J］.Mol Cell Neurosci，1999，14 （4-5）：287-300.

［10］ Lennington J B，Yang Z，Conover J C.Neural stem cells and the regulation of adult neurogenesis［J］.Reprod Biol Endocrinol，2003，1（25）：99.

［11］ Kwon Y K.Effect of neurotrophic factors on neuronal stem cell death［J］.J Biochem Mol Biol，2002，35（1）：87-93.

［12］ Santos-Silva A，Cavalcante L A.Expression of the non-compact myelin protein 2’，3’-cyclic nucleotide 3’-phosphodiesterase （CNPase） in olfactory bulb ensheathing glia from explant cultures［J］.Neurosci Res，2001，40（2）：189-193.

［13］ Dityatev A，Schachner M.Extracellular matrix molecules and synaptic plasticity［J］.Nat Rev Neurosci，2003，4（6）：456-468.

［14］ Schwob J E.Neural regeneration and the peripheral olfactory system［J］.Anat Rec，2002，269（1）：33-49.

①包头医学院第一附属医院 内蒙古 包头 014010

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.20.006

收稿日期：（2015-04-21） （本文编辑：蔡元元）

*基金项目：内蒙古自治区高等学校科学技术研究项目（自然科学研究）中的一般项目（NJ10186）

通信作者：张朝

Impact of Olfactory Ensheathing Cells Combined Neural Stem Cells in Rats Subjected to Acute Spinal Cord Injury and Brain Derived Neurotrophic Factor Expression

CHEN Da-wei，LIU Yan-qing，ZHANG Chao.//Medical Innovation of China，2016，13（20）：022-027

【Abstract】Objective：To explore effect of olfactory ensheathing cells combined with neural stem cells on acute spinal cord injury in rats and brain derived neurotrophic factor（BDNF） expression.Method：The newborn （born 3 days） SD rats hippocampus and olfactory bulb were taken for preparation of neural stem cells and olfactory ensheathing cells.80 SD rats were made model of acute spinalcord injury，the rats were randomly divided into the control group（sham group），NSCs，OECs，NSCs+OECs transplantation group（were the experimental A，B，C group successively），then the cell transplantation.In the preoperative and postoperative 1 day，3，7，14，21 days，adopt BBB score，inclined plane experiments and tested motor evoked potential（MEP N1 wave）preclinical，Last，one rat were selected in each group randomly.Immunohistochemical staining were used to observe and comparison BDNF in the damaged spinal cord tissue localized expression in each group.Result：（1）The change of BBB score：except for the first day，any of experimental group the degree of recovery was significantly higher than the control group（P＜0.05）.From the beginning of the seventh day，the comparison between arbitrary two experimental group was statistically significant difference（P＜0.05）.（2）The changes of the inclined plate test：from the seventh day，the differences between arbitrary the group were statistically significant（P＜0.05）.（3）The change of MEP （N1 wave） latency：from the third day，the differences between arbitrary the group were statistically significant（P＜0.05）.（4）BDNF staining of cells expressing positive change：after cell transplantation，BDNF in the injured spinal cord of Each group rats began to increase.Until third days to reach the peak，after decrease.From the third day，the differences between arbitrary the group were statistically significant（P＜0.05）.Conclusion：When the cell transplantation is used to treat acute spinal cord injury in rats，research show：OECs+NSCs transplantation group achieve the best results.When a single cell specie transplant alone，OECs transplantation has better treatment effect than NSCs transplantation.BDNF expresses highest in the OECs+NSCs transplantation group.

【Key words】Olfactory ensheathing cells； Neural stem cells； Acute spinal cord injury； Brain derived neurotrophic factor