自制带双侧给药管的多通道在体记录电极对前扣带皮层神经元放电活动的观察*

秦霞王锐陈晋源王媛彭源舒赵欣秦国华马洋陈建鸣张策张宇

自制带双侧给药管的多通道在体记录电极对前扣带皮层神经元放电活动的观察*

秦霞①王锐①陈晋源①王媛①彭源舒②赵欣①秦国华①马洋①陈建鸣①张策①张宇①

【摘要】目的：利用在体多通道电生理学记录技术研究前扣带皮层吻侧部（rostral anterior cingulate cortex，rACC）神经元参与情绪情感活动时的放电特征时，除在rACC脑区埋置多通道电极外，还需同时埋置给药管以观察药物对rACC神经元放电特征的影响。本文将介绍带给药管的多通道在体记录电极的制作及埋置方法。方法：自制带双侧给药管的多通道在体记录电极，所采用给药管材质有三种，分别为金属、表面无涂层的石英玻璃纤维（玻璃裸管）和表面有聚酰胺胶涂层且具一定柔韧性的石英玻璃纤维（玻璃涂层管），然后埋植电极并记录神经电信号，最后插管位置组织定位。结果：盐水被注射到目标脑区，即rACC脑区；电极丝也定位于双侧前扣带皮层吻侧部；用带金属给药管的多通道电极，记录到的神经元放电背景噪音较大（信噪比＜3）。用带玻璃裸管的电极可清晰记录到目标神经元的放电活动（信噪比＞3），信噪比与金属管组比较［（5.37±1.35）vs（2.35±0.64）］，差异有统计学意义（P＜0.05），但该玻璃管质硬易碎，不易插入堵丝，也不易在慢性实验中脑部长时间保存。用带玻璃涂层管的电极也可清晰记录到神经元的放电活动（信噪比＞3），信噪比与金属管组比较［（5.20±1.21）vs（2.35±0.64）］，差异有统计学意义（P＜0.05），且易于插入堵丝，便于在动物脑中长时间保留。结论：自制带涂层石英毛细玻璃管的电极成功实现了对某一脑区或核团同步埋植给药管和电极，使得药物干预并记录清醒活动大鼠脑电活动的实验便于进行。

【关键词】双侧给药管； 多通道电极； 前扣带皮层； 神经元放电； 大鼠

First-author’s address：Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

在体多通道电生理技术是采用细胞外记录方法监测活体动物神经元群电活动的方法［1］，最早是将阵列电极植入猴子不同脑区观察其大脑神经元的放电特征［2］，近些年由于新材料和新技术的应用，使该技术在多种动物身上得以推广，研究的内容也日益多样，如研究学习记忆、运动信息的加工整合、神经突触传递的LTP现象等［3-4］。在神经电生理学研究中，为了探讨某一核团或脑区在神经通路中的作用，往往要结合药理学方法，对目标核团或区域给予药物干预［5］。目前在体多通道电生理技术的应用日益增多，该技术有以下优点：（1）在清醒的、自由活动的动物身上记录，并将行为活动与脑电记录同步观察；（2）可跨脑区记录，进行多个核团或脑区之间的同步观察；（3）具有较高的时间（ms）和空间（μm）分辨率；（4）可以长期记录，数周乃至数月；（5）记录到的是神经元的单位放电而不是神经元群的复合电位；（6）一次记录可获得大量神经元的放电数据［1，6］。正因如此，在体多通道电生理学技术受到越来越多的研究者的关注。目前本实验室正从事于前扣带皮层吻侧部（rostral anterior cingulate cortex，rACC）神经元参与痛情绪活动的机制研究［7-10］，涉及到在活体大鼠的双侧rACC脑区既要给予药物干预又要记录神经元的放电活动，如果将埋管和埋置电极分开操作的话，一方面不能满足进行慢性实验的要求，另一方面会对动物造成较大的创伤，影响结果前后的一致性。另外，目前进口的带给药管的多通道电极价格昂贵、成本太高，而国内尚无此类电极上市，为此笔者自行设计了能双侧给药并记录神经元放电的在体记录电极。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠24只，体重240～260 g，由北京海淀兴旺实验动物养殖场提供。大鼠分笼饲养，自由进食，饲养室室温（22±1）℃，相对湿度40%～60%， 12 hrs～12 hrs昼夜循环光照，适应3～5 d后可进行相应的实验。将24只大鼠均分到三种材质给药管组中，每组8只。

1.2 实验材料及仪器 16通道电极：16通道微电极阵列电极基座和电极电路板（Samtec），0.0013 inch镍铬合金丝（CFW），固态聚乙二醇（Enox）；双侧给药管：25G橙色平头针头；表面无涂层的石英毛细玻璃管，内径0.32 mm，外径0.5 mm；表面有聚酰胺胶涂层且具一定柔韧性的的石英毛细玻璃管，内径0.32 mm，外径0.45 mm；另外还需常规大鼠脑手术器械、1%戊巴比妥钠、牙托水、牙托水泥及石蜡油等材料。

1.3 制作流程

1.3.1 16通道电极的制作 （1）将电路板金手指和电极基座一一对应焊接；（2）将镍铬合金丝切成一定长度，然后一根根排于电路板上，共两排，每排8根，左右各四根，中间间隔1.2 mm，丝与丝间距300 μm，一根参考电极排于一侧；（3）轻柔剥掉将穿入电路板上金属孔处电极丝的绝缘层，并将剥好裸露的电极丝一一穿过圆孔；（4）参考电极穿入一侧的孔内，另一侧穿入一根地线；（5）将电极丝与电路板金属孔一一焊好，再将固体聚乙二醇融化后涂于电极丝表面，以起到固定作用；（6）将AB胶1∶1混合后涂于电极基座和电极电路板连接处，以起到固定和绝缘的作用；（7）最后用剪刀剪掉电路板两侧多余的边框，用锋利的眼科剪迅速剪掉电极丝末端部分，保证电极丝末端整齐并暴露横截面。制作完成的电极见图1。

图1 多通道电极图

1.3.2 给药管的制作 笔者分别选用了三种材质的毛细管作为给药管。一种是实验中常用到的金属给药管（图2A），来自于25G橙色平头针头［11］；一种是不带涂层裸露的石英毛细玻璃管（图2B）；一种是表面有聚酰胺胶涂层的石英毛细玻璃管（图2C）。

图2 三种不同材质的给药管

1.3.3 带双侧给药管的电极制作 将给药管用AB胶粘在已做好的16通道电极其中一面，要保证双侧给药管间距离为1.2 mm，给药管与电极丝间的距离为1 mm，粘好后在两个给药管中间插一个U型的堵丝，其中金属管需与地线焊在一起。具体见图3。

图3 带双侧给药管16通道电极

1.4 手术流程 大鼠以1%戊巴比妥钠溶液行腹腔麻醉，固定于脑立体定位仪上，在头部正中切开皮肤/筋膜，双氧水清理骨板暴露Bregma点；按照Paxinos&Watson大鼠解剖图谱［12］，以前囟点为0点，确定rACC下电极的区域：AP（0.5～4.0）、ML （0.5～1.5）、DV（2.0）。待目标脑区打磨好后用微推仪以1 μm/s的速度下2.0 mm，最后用牙托水泥固定。取下Headstage；大鼠回笼单独饲养。待术后1周状态恢复良好后可进行后续实验。

1.5 给药流程 将大鼠自然的固定于啮齿动物固定装置上，轻轻地安抚大鼠，小心拔掉给药管内的管芯。进药针末端通过PE-10管连接于5 μL的微量进样器，进药针头端比给药管长0.3 mm。抽取1 μL的生理盐水，用微量给药泵以0.2 μL/min的速度缓慢将药物泵入rACC。进药针在给药结束后继续停留于给药管里1～2 min，保证药物被充分吸收；同样操作另一侧rACC。

1.6 神经元活动的在体记录 笔者采用美国Blackrock公司的Cerbus128通道神经电生理信号记录系统对神经信号进行采集。该系统主要由多通道电极阵列、Headstage、前置放大器、光纤、神经信号处理器（NSP）、PC工作站等组成。采集到的原始信号可经高频和低频滤波分为两种信号：高频（250 Hz～5 kHz）的胞外动作电位；低频（＜250 Hz）的局部脑区场电位。再经Offline Sorter 和Neuroexplore软件进行处理和分析。

1.7 记录位点的鉴定 大鼠麻醉后将1 μL的滂胺天蓝从给药管缓慢注射至目标脑区；然后剪开胸腔，暴露心脏。将注射针头经心尖插入主动脉，剪掉右心耳。先使用约400 mL的生理盐水冲洗血液，然后缓慢灌注400 mL的4%的多聚甲醛至身体僵硬。灌流结束后，取出全脑，在4%的多聚甲醛中再浸泡2 h，然后30%的蔗糖4 ℃过夜。待组织沉降后便可进行冰冻切片。每片厚30 μm，后贴片，HE染色，中性树脂封片，镜下观察。

1.8 统计学处理 采用GraphPad Prism 6软件进行统计分析，计量资料以（±s）表示，采用oneway ANOVA及多重比较进行分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 组织定位 组织切片、HE染色显示：药物能被准确注射到目标脑区（rACC脑区），而且多通道电极也位于目标脑区，见图4。

2.2 带给药管的多通道电极所测神经信号 采用带金属给药管的多通道电极记录到的大鼠前扣带皮层吻侧部神经元放电的动作电位和场电位背景噪音很大，信噪比＜3，信号往往淹没于背景噪音中无法辨识，将地线缠绕于金属给药管也未能明显改善（图5A）。采用表面无涂层的毛细石英玻璃做给药管，采集到的动作电位和场电位背景噪音较小（图5B），其信噪比与金属管组比较［（5.37±1.35）vs （2.35±0.64）］，差异有统计学意义（P＜0.05），见图6；但由于该玻璃纤维太脆，不利于插入堵丝及长时间记录。采用表面有涂层的石英毛细玻璃管做给药管，可清晰记录到rACC脑区神经元发放的动作电位和场电位，波形较好、背景噪音较小，信噪比＞3（图5C）。信噪比与金属管组比较［（5.20±1.21）vs（2.35±0.64）］，差异有统计学意义（P＜0.05），见图6；且该玻璃管柔韧性较好，便于插入堵丝，长时间记录也未破损。

图4 前扣带皮层吻侧部位置（rACC脑区）

图5 三种材质给药管多通道电极记录的spike波形

图6 三种带不同类型给药管的多通道电极测得神经元放电的信噪比比较

3 讨论

中枢神经元放电的在体多通道同步记录技术（in vivo multi-channel recording methods for centural neural activities）是采用细胞外记录的方法来监测神经元群的同步电活动［13-14］。与离体实验方法相比，应用这一方法可以记录清醒、自由活动动物脑区神经元的放电活动［15-17］，将行为学和电生理学的方法相结合，可直观地分析大脑对外部事件的编码机制［18-19］。与单通道电生理技术相比，该技术克服了单通道电生理技术所具备的弊端，即一次只能记录一个神经元放电，以及单通道记录时动物活动受限，无法将外部事件与神经元放电相同步［17］。由于该技术的优越性，在神经生物学领域受到广泛使用，尤其在对与学习认知相关机制的探索中［20-21］，同时在对神经环路的研究中常需要对某个或某几个核团进行给药处理［22］，因此能长期多次给药并记录电信号的带给药管的多通道电极使之成为可能。由于神经元放电活动较微弱，因此很容易受周围环境的影响［23］。笔者尝试用常规金属针头改作为给药管，发现电极记录的信号背景噪音很大，将地线缠绕并焊于其上也未能明显缓解。然后改用具有绝缘特征的石英毛细玻璃管作为给药管，背景噪音明显减小，但是硬质易碎的石英玻璃管不利于笔者实验操作；最后笔者找到了表面有聚酰胺胶涂层且具一定柔韧性的石英毛细玻璃管替代，效果很好。经笔者改良后的带双侧给药管的多通道电极，可保证药物扩散到目标核团的，而且能清晰记录到活体动物在行为活动时神经元的同步放电活动。

需要注意的是：（1）应保证电极尖端未被绝缘层包裹，这样才能使得电极与神经元接触；（2）剥离电极表面绝缘层时要轻柔，可多次操作，以免断开；（3）手术剥离硬脑膜也要轻柔，切勿损伤脑实质或导致出血；（4）下电极的速度要慢，一般来说，电极经过的地方神经元会失活，因此记录电极只进不退；（5）电极要固定好以后才可将Headstage拔下，以免将电极位置移动；（6）给药时速度也要慢，一般为0.2 μL/min，因为如果给药太快会对细胞产生冲击作用，而使其位置发生改变；注药结束后要停留5～10 min再将注射内芯移除，这样有利于药物被充分吸收。

综上所述，本实验成功设计了带双给药管的16通道电极，使得能在对目标核团给予药物处理后记录神经元的放电活动，满足了笔者的实验需求，而且，药理学实验与在体记录相结合可以获得更有意义的研究成果。

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①山西医科大学 山西 太原 030001

②山西医科大学第一临床医学院

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.20.004

收稿日期：（2016-02-29） （本文编辑：蔡元元）

*基金项目：国家自然科学基金资助项目（81371254）

通信作者：张宇

Observation of Recording the Electrical Activities in Anterior Cingulate Cortex Neurons by Using Home-made Multi-channel Electrode with Double Cannulas

QIN Xia，WANG Rui，CHEN Jin-yuan，et al.//Medical Innovation of China，2016，13（20）：013-017

【Abstract】Objective：In order to explore the firing characteristics of the rostral anterior cingulate cortex （rACC） neurons，which participate in the emotional activities by using the multi-channel in vivo recording techniques，we should implant a multi-channel electrode and cannulas in the rACC area in rats，while to observe the influence of drugs on the firing characteristics in ACC neurons at the same time.A method of home-made multichannel with double cannulas is introduced here.Method：Three different materials of cannulas，including metal，quartz capillary without or with polyamide coating were applied.Then the home-made electrode was implanted to record the neuronal activity.In the end，the cannula site was localized.Result：The saline were respectively injected into ACC region in different rats，and electrode wire are also located in this region.Using home-made multi-channel electrode with double metal cannulas，the signal to noise ratio were smaller （SNR＜3）.Electral signal could be recorded by using the home-made multi-channel electrode with double quartz capillary without or with polyamide coating， their signals both were excellent （SNR＞3），the SNR compared with metal cannulas one［（5.37±1.35） vs （2.35±0.64）］，there had significant statistical difference（P＜0.05），but the bare quartz capillary was harder，fragile and difficult to maintain for a long time in the brain.With glass coating tube electrode could also be clearly recorded neurons discharge activity（SNR＞3），the SNR compared with metal cannulas one［（5.20±1.21） vs （2.35±0.64）］，there had significant statistical difference（P＜0.05），while the coating one was elastic and easy to insert a plug in it and can maintain a long time.Conclusion：The home-made multi-channel electrodes with double cannulas can be successfully applied to some of experiments，which need to be recorded about neural activities after drugs administration to one brain area or neural nuclei.

【Key words】Double cannulas； Multi-channel electrodes； Anterior cingulate cortex； Neurons activities； Rat