比较3种不同储存条件对纯钛SLA表面生物学性能的影响*

崔玲

比较3种不同储存条件对纯钛SLA表面生物学性能的影响*

崔玲①

【摘要】目的：比较3种不同储存条件对纯钛SLA表面生物学性能的影响。方法：采用喷砂加酸蚀的方法在商用二级纯钛钛片上制备SLA表面，并将其置于3种不同环境中储存不同的时间，分组如下：Ⅰ组钛片为常温常压保存；Ⅱ组钛片为真空保存；Ⅲ组钛片NaCl溶液中保存。分别对不同组别钛片的理化性质、生物活性进行比较。结果：三组之中，Ⅲ组中的纯钛SLA表面表面自由能、蛋白质吸附率、MG63成骨细胞的黏附、增殖、ALP活性及表面矿化效果均为最佳，Ⅰ组中的纯钛SLA表面最容易受到C元素的污染，理化性能及生物活性均明显下降。结论：不同储存条件对纯钛SLA表面的理化性质、生物活性具有明显的影响。将处理后的钛片置于NaCl溶液中有利于降低C污染，并促进钛片表面的蛋白质吸附、细胞黏附、增殖与分化。

【关键词】储存条件； 纯钛SLA表面； 表面理化性能； 生物活性；

First-author’s address：The Eighth People’s Hospital of Guangzhou，Guangzhou 510440，China

随着人们对口腔健康重视程度的不断提高，人工种植牙在口腔修复中的应用也越来越广泛。纯钛因其良好的稳定性、生物相容性、机械性能成为目前临床最常使用的种植体材料［1］。但其经生物活化后会随保存时间的延长出现老化现象，选择合适的保存方法延缓甚至组织老化的发生直接影响到种植牙修复的成功率［2］。本文通过分析不同保存方法下纯钛表面理化性能与生物活性的变化情况，探讨最佳保存方法，具体报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取将商用二级纯钛片作为实验材料，并将其切割成15 mm×15 cm×1.5 mm的钛片。经SiC防水砂纸打磨抛光后，采用Al2O3颗粒进行喷砂，H2SO4/HCl混合酸进行酸蚀处理，获得纯钛SLA表面。经超声清洗、干燥、紫外线消毒等一系列方法处理后，按照预定设计储存于3种不同的条件下：Ⅰ组钛片为常温常压密封保存；Ⅱ组钛片为真空保存；Ⅲ组钛片保存在NaCl溶液中。

1.2 方法

1.2.1 不同储存条件下钛片的理化性质变化情况 将三组钛片在不同保存方式下保存3、14、28 d后，每组随机抽取3片进行钛片表明理化性能分析。在超高真空的环境下，通过扫描电镜与X线光电子能谱仪分别对各组钛片的表面形貌、表面元素构成进行观察并分析。然后，通过表面粗糙度测量仪分析不同保存方式和保存时间下钛片的表面粗糙度，以利于钛片表面拓扑结构的分析。再对不同组别钛片在2 μL ddH2O中的表面接触面积进行测定。

1.2.2 不同储存条件下钛片的生物活性变化情况

1.2.2.1 蛋白质吸附情况 选择牛血清白蛋白作为模型蛋白，并将300 μL浓度为1 mg/mL的蛋白质溶液转移到不同组别钛片表面，在37 ℃条件下孵育1 h，弃去未吸附的蛋白液后，将其与微喹啉二甲酸继续混合并在相同条件下孵育0.5 h。在562 nm的波长下测定OD值、绘制标准曲线，并据此计算蛋白质吸附量。

1.2.2.2 MG63成骨细胞的黏附与增殖情况 MG63成骨细胞株经培养、传代、接种并冲洗、消化、离心、重悬等处理后，通过对MG63成骨细胞悬液进行细胞计数，按照操作要求调整细胞浓度，然后接种于不同组别钛片表面，于37 ℃、5%二氧化碳浓度的细胞培养箱中进行培养、换液，至实验时点后经漂洗、多聚甲醛处理、常温固定、缓冲液再次漂洗、通透细胞、荧光剂染色、漂洗、干燥等一系列处理后，在专业的显微镜成像系统中随机选取10个视野进行图像采集，计算并统计钛片上吸附细胞的数目。同时，选择MTS试剂盒对MG63成骨细胞在不同组别钛片上的增殖情况进行检测。

1.2.2.3 不同钛片表面的碱性磷酸酶活性 通过碱性磷酸酶（ALP）试剂盒对不同组别钛片上的MG63成骨细胞ALP活性进行测定，检测使用酶标仪，检测波长为405 nm，读取吸光度绘制标准曲线，并通过ALP活性分析成骨细胞在不同钛片上的早期分化活性［3］。

1.2.2.4 不同钛片表面MG63成骨细胞的矿化情况测定 细胞培养的第14天，在不同钛片表面的培养细胞层上实施茜素红染色，并行阳性矿化结节检测，检测波长为620 nm，通过矿化能力的测定分析成骨细胞在不同钛片上的晚期分化活性［4］。

蛋白质吸附实验及细胞实验均采用储存了28 d的钛片。

1.3 统计学处理 本次实验数据采用SPSS 12.0统计学软件进行数据分析，计量资料以（±s）表示，比较采用t检验，对存在交互效应的组别可以通过单因素方差分析及Levene’s test检验进行分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同组别钛片表面理化性质检测结果

2.1.1 不同组别钛片表面元素构成比较 经扫描电镜观察，不同组别钛片在保存不同时间后，其钛片表面的形貌基本相似，均为多孔状结构，且分布均匀、结构规则。但在表面元素构成上，Ⅰ组的C元素随保存时间延长不断构成比例不断升高，而O元素、Ti元素、N元素不断降低，与Ⅱ、Ⅲ组比较有统计学差异（P＜0.05），见表1。

表1 不同组别钛片表面元素构成比较（±s） %

表1 不同组别钛片表面元素构成比较（±s） %

组别 时间 C O Ti NⅠ组（n=3）保存3 d 37.3±1.8 47.0±2.3 16.8±1.6 1.5±0.4保存14 d 42.9±2.1 41.1±1.8 16.2±1.4 1.0±0.3保存28 d 48.5±2.6 37.5±2.0 14.7±1.2 0.8±0.2Ⅱ组（n=3）保存3 d 27.4±1.5 52.0±2.7 18.9±1.5 1.7±0.3保存14 d 27.8±2.3 51.6±2.0 18.6±1.2 2.0±0.2保存28 d 28.1±1.9 51.2±1.9 19.2±1.0 0.9±0.5Ⅲ组（n=3）保存3 d 25.7±1.6 55.2±2.5 19.8±2.0 0.8±0.4保存14 d 29.3±2.0 52.0±2.1 18.9±1.6 0.8±0.5保存28 d 31.4±2.0 50.5±2.3 18.1±1.4 1.0±0.3

2.1.2 不同组别钛片表面ddH2O接触面积比较 不同组别钛片的粗糙程度参数a、St、Sdr比较无明显差异，处于同一水平。而其亲水性比较存在明显的变化，Ⅰ组的纯钛SLA表面，则均匀的随储存时间的延长，钛片与ddH2O表面接触面积不断下降，而Ⅲ组下降程度最低，Ⅰ组与Ⅱ、Ⅲ组ddH2O表面接触面积比较差异均有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 不同组别钛片表面ddH20接触面积比较（±s） %

表2 不同组别钛片表面ddH20接触面积比较（±s） %

组别 保存3 d 保存14 d 保存28 dⅡ组（n=3） 2.87±0.31 2.29±0.25 2.01±0.15Ⅱ组（n=3） 98.93±5.98 52.95±3.55 42.72±2.46Ⅲ组（n=3） 109.81±6.01 59.31±3.18 44.16±1.97

2.2 不同组别钛片表面的生物活性检测结果

2.2.1 不同组别钛片表面蛋白吸附率比较 Ⅰ组钛片随着保存时间延长出现显著下降，而Ⅱ、Ⅲ组波动相对较小，均比Ⅰ组高，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表3。

2.2.2 不同组别钛片表面MG63成骨细胞黏附数目比较 随着细胞培养时间的延长，钛片表面MG63成骨细胞黏附数目均不断增长，但Ⅰ组钛片的黏附数目最低，在不同培养时间下的比较均显著低于其他组别，Ⅲ组钛片的黏附数目最高，显著高于Ⅰ、Ⅱ组钛片，比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表4。

表3 不同组别钛片表面蛋白质吸附率比较（±s） %

表3 不同组别钛片表面蛋白质吸附率比较（±s） %

组别 保存3 d 保存14 d 保存28 dⅠ组（n=3） 10.16±0.43 6.21±0.23 4.87±0.15Ⅱ组（n=3） 10.03±0.57 8.93±0.51 8.81±0.34Ⅲ组（n=3） 9.97±0.56 9.23±0.45 9.01±0.41

表4 不同组别钛片表面MG63成骨细胞黏附数目比较（±s） ×103

表4 不同组别钛片表面MG63成骨细胞黏附数目比较（±s） ×103

组别 培养0.5 h 培养1 h 培养2 h 培养4 hⅠ组（n=3） 0.63±0.23 1.52±1.04 4.67±1.98 10.65±2.97Ⅱ组（n=3） 10.25±3.20 11.55±3.07 13.98±4.59 16.09±5.76Ⅲ组（n=3） 11.23±3.83 12.21±4.42 14.57±4.35 17.72±5.62

2.2.3 不同组别钛片表面MG63成骨细胞增殖后吸光度比较 在细胞培养的第1、3天均有Ⅲ组＞Ⅱ组＞Ⅰ组的情况，Ⅱ与Ⅲ组无统计学差异，但均比Ⅰ组高，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表5。

表5 不同组别钛片表面MG63成骨细胞增殖后吸光度比较（±s）×102

表5 不同组别钛片表面MG63成骨细胞增殖后吸光度比较（±s）×102

组别 培养1 d 培养3 dⅠ组（n=3） 35.0±1.0 100.9±4.7Ⅱ组（n=3） 41.1±1.6 124.7±5.1Ⅲ组（n=3） 42.2±1.2 133.6±5.2

2.2.4 不同组别钛片表面MG63成骨细胞ALP吸光度比较 培养7 d，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组钛片表面MG63成骨细胞ALP吸光度值分别为（25.0±0.6）、（25.1±0.8）、（24.8±0.7）×102，三组大致相近，比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2.5 不同组别钛片表面矿化溶解后的吸光度比较 培养14 d，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组钛片表面矿化溶解后的吸光度值分别为（3.5±0.3）、（3.7±0.3）、（4.1±0.5）×102，Ⅲ组＞Ⅱ组＞Ⅰ组，比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

人工种植体在口腔修复治疗中应用广泛，但种植成功率受多种因素的影响，一方面，种植体植入后需要较长的愈合时间（6～12周），此间容易受多种风险因素的干扰，另一方面，受限于材料的生物相容性，种植体和骨结合率总体上较低（50%～65%），在实际应用中受到较大的限制［5］。如何使种植体更快更好与骨结合是研究的重点和难点［6-7］。

种植牙的植入与骨结合的过程实际上是生物组织与生物活性材料化学键的结合过程，而作为影响骨结合速度、强度的主要因素，种植体表面的生物活性高低、理化性能好坏至关重要，纯钛表面的理化性能与生物活性之间也息息相关。紧密相连［8-9］。钛金属是一种生物惰性材料，从本身的性质来说，其与骨组织之间存在较大的差异，一旦纯钛表面形成钝态氧化膜之后，则其与骨组织的化学键性结合更加困难［10-13］。因而，临床应用中通常采用表面活化的方法来实现种植体与生物组织直接键性结合的目的。无论是何种纯钛表面生物活化处理方法，均存在时效性。往往通过一段时间的保存后，纯钛表面经处理后得到的高表面能及高生物活性效应会逐渐消失，生物活性也会随着保存时间的延长出现明显降低的情况，也即钛表面生物活性的老化［14-16］。

通过蛋白质吸附实验、成骨细胞在材料表面的黏附、增殖、分化、矿化情况的分析，则可以对材料的生物活性进行反映。本文对比较了3种不同储存条件对纯钛SLA表面生物学性能的影响，结果发现，常温常压下密封保存的钛片保存过程中容易受到C污染，导致其C元素构成比例增加，导致其表面亲水性下降，影响其蛋白吸附能力和细胞黏附、增殖及分化的能力。而将钛片真空保存及液体保存可以降低C元素污染，并能保持超级亲水性，有利于钛片的蛋白吸附及细胞的黏附、增殖及分化。其中，NaCl液体保存的效果最佳。卢海宾等［17］的研究比较了经酸蚀处理的钛片分别保存于常温常压条件、ddH2O、NaCl和CaCl2溶液四种条件下的表面C元素含量、静态水接触角、MG63成骨细胞在接种不同时间后的黏附数目、细胞增殖能力，结果大致与本文相似。由此可见，这种趋势在不同的纯钛表面类型具有一致性。

不同储存条件对纯钛SLA表面的理化理化性质、生物活性具有明显的影响。将处理后的钛片置于NaCl溶液中有利于降低C污染，并促进钛片表面的蛋白质吸附、细胞黏附、增殖与分化。

参考文献

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（WSTJJ20140114441781198501014116）

①广州市第八人民医院 广东 广州 510440

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.20.003

收稿日期：（2016-06-02） （本文编辑：蔡元元）

*基金项目：广东省医学科学项目

Comparison of the Influence of Three Different Storage Conditions on the Biological Properties of Titanium SLA Surface

CUI Ling.//Medical Innovation of China，2016，13（20）：009-012

【Abstract】Objective：To compare the effect of three different storage conditions on the biological properties of pure titanium SLA surface.Method：SLA surface were produced with commercial pure titanium disk by treated with the method of sand blasting and acid-etch，and store in three different environments of different time，group Ⅰ：atmospheric pressure preservation；group Ⅱ：vacuum preservation；group Ⅲ：NaCl solution.Physical and chemical properties， biological activity were compared.Result：Among the three groups，the pure titanium SLA surface in group Ⅲ showed the best effect in the surface free energy，protein adsorption rate，MG63 osteoblast adhesion， proliferation and ALP activity and mineralization.Physical and chemical properties and biological activity of surface group Ⅰ decreased obviously because of C element pollution.Conclusion：The difference of storage conditions have significant impacts on physical and chemical properties，biological activity of pure titanium SLA surface.Storing titanium plate in NaCl solution is helpful to reduce the pollution of the C，and increase protein adsorption，cell adhesion， proliferation and differentiation on the pure titanium SLA surface.

【Key words】Storage conditions； Pure titanium surface of SLA； Surface physical and chemical properties； Biological activity