HPLC测定参附强心丸中东莨菪内酯和7-羟基香豆素含量

吴颖欣王汝上（.广东省佛山市中医院　佛山　528000；2.广州康臣药物研究有限公司　广州　50530）

HPLC测定参附强心丸中东莨菪内酯和7-羟基香豆素含量

吴颖欣1王汝上2*（1.广东省佛山市中医院佛山528000；2.广州康臣药物研究有限公司广州510530）

摘要：目的：建立HPLC法测定参附强心丸中东莨菪内酯和7-羟基香豆素含量的方法。方法：采用二极管阵列检测器，色谱柱为Phenomenex Luna C1（8250mm×4.6mm，5μm）；流动相为甲醇-0.5%冰乙酸水溶液，梯度洗脱；流速为1.0mL/min；检测波长为345nm。结果：东莨菪内酯线性范围为0.0760～0.3800μg（R2=0.999），平均回收率为104.54%，RSD为2.27%，重复性RSD为1.22%（n=6），精密度RSD为0.90%（n=6），稳定性RSD为0.91%；7-羟基香豆素线性范围为0.0300～0.1500μg（R2=0.999），平均回收率为102.51%，RSD为1.04%，重复性RSD为5.08%（n=6），精密度RSD为0.91%（n=6），稳定性RSD为0.91%。结论：本研究所建方法稳定、可靠，可作为该制剂的质量控制方法。

关键词：参附强心丸 HPLC东莨菪内酯 7-羟基香豆素

参附强心丸处方由人参、桑白皮、附子（制）、葶苈子、猪苓、大黄组成，益气助阳、强心利水，可用于慢性心力衰竭引起的心悸、气短、胸闷喘促、面肢浮肿等证属心肾阳衰者［1］。桑白皮是参附强心丸处方中的主要药味之一，东莨菪内酯和7-羟基香豆素为桑白皮中主要效应成分。本文建立了HPLC法测定参附强心丸中东莨菪内酯和7-羟基香豆素的方法，该方法结果准确、重复性好且快速简便，可作为参附强心丸质量的定量检测方法。

1仪器与试药

Agilent1200型高效液相色谱仪，DAD检测器，Agilent ChemStations数据处理软件（安捷伦科技有限公司）；Phenomenex Luna C1（8250mm×4.6mm，5μm）色谱柱；KQ3200DB型数控超声仪（巩义市予华仪器有限责任公司）；BS224S分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）。

参附强心丸（为大蜜丸，批号分别为：20150201、20150202、20150203，购于天津中新药业集团股份有限公司达仁堂制药厂）；东莨菪内酯对照品（购于中国食品药品检定研究院，批号110768-200504）、7-羟基香豆素对照品（购于中国食品药品检定研究院，批号111739-200501）；甲醇（色谱纯，默克公司）；超纯水（本实验室制备）；其他溶剂均为分析纯。

2方法与结果

2.1色谱条件：色谱柱为Phenomenex Luna C1（8250mm×4.6mm，5μm），流动相为甲醇-0.5%冰乙酸水溶液梯度洗脱，见表1，检测波长为345nm，流速为1.0mL/min，进样量为10μL，理论板数按东莨菪内酯峰面积计算不低于4000，色谱图谱见图1。

表1梯度洗脱

2.2样品制备方法考察［2］：提取时间考察：本品适量，粉碎，取粉末约2 g，平行4份，精密称定，置索氏提取器中，加入80mL95%乙醇分别提取4、5、6、7h，水浴蒸干，残渣用40mL0.5%H2SO4水溶液加热回流3h，放冷，溶液用氯仿萃取4次，每次30mL，合并氯仿液，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至10mL，摇匀，0.45μm滤膜滤过，即得。结果提取5h时东莨菪内酯及7-羟基香豆素含量最高，因此，选择提取时间为5h，结果见表2。

表2不同提取时间考察结果

酸处理时间考察：本品适量，粉碎，取粉末约2g，平行4份，精密称定，置索氏提取器中，加入80mL95%乙醇提取5h，水浴蒸干，残渣用40mL0.5%H2SO4水溶液分别加热回流2、3、4、5h，放冷，溶液用氯仿萃取4次，每次30mL，合并氯仿液，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至10mL，摇匀，0.45μm滤膜滤过，即得。结果酸处理3h时东莨菪内酯及7-羟基香豆素含量最高，因此，选择酸处理时间为3h，结果见表3。

表3超声时间考察结果

2.3对照品及供试品溶液制备：对照品溶液：分别取东莨菪内酯及7-羟基香豆素对照品适量，精密称定，置100mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，得两者浓度分别为0.0206mg/mL和0.0105mg/ mL，作为东莨菪内酯及7-羟基香豆素混合对照品溶液。

供试品溶液：本品适量，粉碎，取粉末约2g，平行4份，精密称定，置索氏提取器中，加入80mL95%乙醇提取5h，水浴蒸干，残渣用40mL0.5%H2SO4水溶液加热回流3h，放冷，溶液用氯仿萃取4次，每次30mL，合并氯仿液，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至10mL，摇匀，0.45μm滤膜滤过，取续滤液，即得。

阴性样品溶液：取不含桑白皮的糖肾处方量药材，按成品制备工艺及供试品溶液制备方法制备。

2.4线性范围、最低检测限及最低定量限考察：分别取东莨菪内酯及7-羟基香豆素对照品适量，精密称定，置于100mL容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，得东莨菪内酯及7-羟基香豆素浓度分别为0.0760mg/mL、0.0300mg/mL混合对照品，备用。分别精密吸取上述对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，置于10mL容量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，得系列稀释对照品溶液。分别精密吸取以上对照品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，记录峰面积，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程分别为Y=3828X-9.255（R2=0.999）、Y=2759X-2.455（R2=0.999）。可见，东莨菪内酯进样量在0.0760～0.3800μg范围内线性关系良好；7-羟基香豆素进样量在0.0300～0.1500μg范围内线性关系良好。

取东莨菪内酯及7-羟基香豆素浓度分别为7.60μg/mL、3.00μg/mL的混合对照品溶液适量，分别稀释至浓度为10、50、100倍，得稀释后对照品溶液，各精密吸取10μL，测定，取峰面积为噪音三倍（S/N=3）时的进样量为最低检测限（LOD），东莨菪内酯及7-羟基香豆素检测限分别为0.076μg/mL、0.060μg/mL；取峰面积为噪音十倍（S/N=10）时的进样量为最低定量限（LOQ），东莨菪内酯及7-羟基香豆素定量限为0.152μg/mL、0.300μg/mL。

2.5精密度试验：取浓度分别为0.0206mg/mL、0.0105mg/mL东莨菪内酯及7-羟基香豆素混合对照品溶液，连续进样6次，计算RSD值，结果表明精密度良好。结果见表4。

表4精密度试验结果

2.6稳定性试验：分别精密吸取同一供试品溶液，于配制后0、2、4、8、12、24h进样测定，结果表明24h内稳定，见表5。

表5稳定性试验结果

2.7重复性试验：取本品适量，粉碎，取粉末约2g，精密称定，平行6份，按供试品溶液制备方法制备，分别进样2次，测定东莨菪内酯及7-羟基香豆素的含量，计算RSD值，结果表明本法重复性良好，见表6。

表6重复性试验结果

2.8加样回收试验：取已知东莨菪内酯及7-羟基香豆素含量的本品粉末约1.7g，分别平行6份，精密称定；分别精密加入浓度分别为0.0206mg/mL、0.0105mg/mL的东莨菪内酯及7-羟基香豆素混合对照品5mL，挥干，按供试品制备方法处理，按色谱条件项下方法进样10μL测定，每份样品进样两针，计算其回收率及RSD值，结果见表7。

表7加样回收试验结果

2.9三批样品含量测定：分别取三批样品粉末约2g，精密称定，平行2份，按供试品制备方法处理，按色谱条件项下方法进样10μL测定，结果见表8。

表8三批样品中东莨菪内酯及7-羟基香豆素含量

可见，三批样品东莨菪内酯及7-羟基香豆素含量均较低，可以两者之和作为含量指标。

3讨论

3.1色谱条件研究

3.1.1系统适应性研究：色谱分离：本色谱条件下，东莨菪内酯及7-羟基香豆素的色谱峰保留时间分别为42、40min，与其他峰分离良好，分离度均大于1.5，对称性均大于0.94，符合标准。

理论塔板数：考虑到不同色谱柱条件（柱长、载体性能、填充情况、流动相、使用时间等）差异，暂定东莨菪内酯及7-羟基香豆素色谱峰的理论塔板数均不小于4000。

3.1.2波长选择：取东莨菪内酯及7-羟基香豆素混合对照品200～400nm波长处进行紫外扫描，于345nm处有最大吸收，确定东莨菪内酯及7-羟基香豆素的检测波长为345nm。

3.1.3专属性试验：分别取对照品溶液、供试品溶液以及阴性样品各10μL，按色谱条件进样测定，结果表明阴性无干扰。

本研究所建立方法简便易行、结果准确且重复性好，可作为参附强心丸质量的定量检测方法。

参考文献

［1］张娟，孙琳，郑歆，等.HPLC法测定参附强心丸中大黄素、大黄酚的含量［J］.世界科学技术—中医药现代化，2009，11（3）：457-460.

［2］徐小飞，陈康，陈燕霞，等.桑白皮蜜炙前后东莨菪内酯含量变化研究［J］.广东药学院学报，2011，27（6）：579-581.

中图分类号：R284

文献标识码：A

文章编号：1672-8351（2016）07-0006-03

*通讯作者

HPLC Determination of Scopoletin and 7-Hydroxycoumarin Content in Shenfu Qiangxin Pill

Wu Yingxin1Wang Rushang2*（1.Foshan Hospital of TCM，Guang Dong，Fo Shan，528000；2.Guangzhou Consun Drug Research Ltd.，Guang Dong，Guang Zhou，510663）

Abstract：Objective：To study and to determine Scopoletin and 7-Hydroxycoumarin Content in Shenfu Qiangxin Pill using HPLC. Methods：The method adopts DAD detector，Phenomenex Luna C18（250mm×4.6mm，5μm）column，mobile phase was methanol（A）-0.2%aqueous acid aqueous solution（B），with gradient elute.The flow rate was 1.0 mL/min，detection wavelength was 280 nm. Results：Scopoletin linear in the range of 0.0760～0.3800μg（R2=0.999），the average recovery was 104.54%，RSD 2.27%repeatability RSD was 1.22%（n=6），precision RSD was 0.90%（n=6）stability of RSD is 0.91%；7-hydroxycoumarin linear in the range of 0.0300～0.1500μg（R2=0.999），the average recovery was 102.51%，RSD 1.04%repeatability RSD was 5.08%（n=6）precision RSD was 0.91% （n=6），the stability of RSD 0.91%.Conclusion：The method is stable and reliable with a good reproducibility and to be used to control its quality with combination assaying.

Key words:Shenfu Qiangxin Pill HPLC Scopoletin 7-Hydroxycoumarin