发酵豆粕中大分子蛋白质和肽含量对仔猪小肠绒毛结构的影响

张露露　王昕陟*　刘旭龙　吕秋威　郁　恒

(1.沈阳农业大学畜牧兽医学院，沈阳110866；2.沈阳波音饲料有限公司，沈阳110141)



发酵豆粕中大分子蛋白质和肽含量对仔猪小肠绒毛结构的影响

张露露1王昕陟1*刘旭龙2吕秋威2郁恒2

(1.沈阳农业大学畜牧兽医学院，沈阳110866；2.沈阳波音饲料有限公司，沈阳110141)

摘要：本试验旨在研究豆粕中大分子蛋白质和肽含量对仔猪小肠绒毛结构的影响。采用凝胶过滤色谱技术分析豆粕中大分子蛋白质和肽含量。选取40头断奶仔猪，随机分成4个处理：去皮豆粕处理、发酵豆粕C处理、发酵豆粕E处理和动物蛋白处理。试验期5周。结果表明：去皮豆粕中大分子蛋白质含量约占80%，发酵豆粕中约占50%，甚至降至24%；发酵豆粕中肽含量约占19%，去皮豆粕中仅有2.7%。与去皮豆粕处理相比，发酵豆粕C处理十二指肠绒毛高度显著提高(P<0.05)，发酵豆粕E、发酵豆粕C处理十二指肠、空肠隐窝深度显著下降(P<0.05)，发酵豆粕E、发酵豆粕C处理十二指肠和空肠的绒毛高度/隐窝深度均显著升高(P<0.05)。由此可见，豆粕中大分子蛋白质含量与小肠绒毛高度/隐窝深度呈负相关；发酵豆粕能够在断奶仔猪饲料中使用，并且有效改善断奶仔猪小肠绒毛结构。

关键词：发酵豆粕；凝胶过滤色谱；小肠绒毛结构

近年来，养殖业发展迅速，对饲料原料，尤其是蛋白质原料的需求量日益增加。但动物性蛋白质原料资源匮乏、价格昂贵且安全系数低，迫使人们将目光锁定植物性蛋白质原料，发酵豆粕就是其中之一。研究表明，豆粕经发酵后，抗营养因子含量下降，部分大分子蛋白质降解为肽和氨基酸[1]，缓解了对断奶仔猪小肠绒毛结构的影响[2]，部分大分子蛋白质甚至降解为更易吸收的小肽[3]。大分子蛋白质和肽含量的不同是去皮豆粕与发酵豆粕的主要区别之一。本试验选取2种发酵豆粕，以去皮豆粕和动物性蛋白质为对照，主要通过凝胶过滤色谱(gel filtration chromatography,GFC)技术分析豆粕中大分子蛋白质和肽含量，探讨其对小肠绒毛高度、隐窝深度以及绒毛高度/隐窝深度(V/C)的影响，旨在为发酵豆粕在饲料中的广泛应用提供数据基础和科学依据。

1材料与方法

1.1GFC技术分析豆粕中蛋白质含量

原料：去皮豆粕、发酵豆粕C、发酵豆粕E等豆粕产品(收集自沈阳波音饲料有限公司)。

主要仪器和设备：Agilent 1260高效液相色谱仪；FD-1100型冷冻干燥仪。

主要试剂：牛血清白蛋白、细胞色素c等标准品(购自北京普天同创生物科技有限公司)。

1.1.1GFC操作方法

按表1色谱条件进行分析。记录标准品保留时间(t)，制作标准曲线。结合样品峰面积(S)和标准曲线方程，计算豆粕样品中肽含量分布。

表1　色谱条件Table 1　The chromatographic conditions

1.1.2标准品分析结果

标准品名称及保留时间见表2。

1.1.3样品蛋白质和肽含量分布结果

保留时间约10 min时，3种豆粕都有较大吸

收峰(图1、图2、图3)。由表3可知，去皮豆粕中分子质量约37 ku的蛋白质约占80%，发酵豆粕中仅占50%，甚至降至24%；而发酵豆粕中肽含量高达19%，去皮豆粕中仅有2.7%。

表2　标准品名称及保留时间Table 2　Standard name and retention time

图1　去皮豆粕中肽类分布Fig.1　Distribution of peptide in dehulled soybean meal

1.2试验设计

原料：从上述GFC技术分析结果中选出大分子蛋白质含量由高至低的去皮豆粕、发酵豆粕E、发酵豆粕C 3种产品。

试验动物：40头28日龄断奶、均重10 kg的三元(杜洛克×长白×大白)杂交仔猪。

主要仪器和试剂：DM4000 B LED Leica显微镜；磷酸盐缓冲液。

40头仔猪随机分为4处理，每处理3个重复，每重复3头猪(其中一个重复为4头猪)。以去皮豆粕处理为负对照组，植物性蛋白质原料为去皮豆粕；发酵豆粕C处理和发酵豆粕E处理为试验组，植物性蛋白质原料分别为发酵豆粕C和发酵豆粕E；动物蛋白处理为正对照组。参照NRC(1998)仔猪和保育猪营养标准并结合生产实践，以去皮豆粕总蛋白质含量为基准，采用等蛋白质含量替换的方式，配制其他处理饲粮(表4)。试验为期5周，自由采食，按日常生产流程管理。

图2　发酵豆粕E中肽类分布Fig.2　Distribution of peptide in fermented soybean meal E

图3　发酵豆粕C中肽类分布Fig.3　Distribution of peptide in fermented soybean meal C 表3　豆粕样品中蛋白质的分布 Table 3　Distribution of soybean meal protein

名称Name项目Items数值Values去皮豆粕Dehulledsoybeanmealt/min5.2429.2389.62810.03410.17511.14413.56W/u38823.081372.486236.679147.615125.29240.6052.446S/%79.5360.5310.9790.5810.65114.5773.146发酵豆粕EFermentedsoybeanmealEt/min5.2848.8689.8009.98010.76311.13813.547W/u36972.601572.743193.776157.18163.23940.8892.484S/%51.1043.1766.5263.5716.16924.1205.333发酵豆粕CFermentedsoybeanmealCt/min5.3316.4047.7348.2458.8269.78211.11813.533W/u35006.20210052.6372141.0661181.884601.409197.87541.8512.524S/%24.26617.0261.8636.5277.24112.04027.4113.626

t：保留时间 retention time；W：分子量 molecular weight；S：峰面积 peak area。

1.3检测指标和方法

试验期内，记录仔猪每日采食量、腹泻率(以粪便黏稠呈糊状或水样为腹泻粪便)；试验期末，各处理仔猪分别称重，计算平均日采食量、平均日增重、料重比、腹泻率。计算公式如下：

平均日增重=(试验期末仔猪平均体重- 试验初期仔猪平均体重)/试验天数； 平均日采食量=(试验初期总料量- 试验期末余料量)/试验天数； 料重比=平均日采食量/平均日增重； 腹泻率(%)=(试验期内仔猪腹泻头数/ 试验天数)×100。 表4　试验饲粮组成及营养水平Table 4　Composition and nutrient levels of experimental diets　%

1)预混料为每千克饲粮提供 The premix provided the following per kg of diets：VA 12 000 IU，VD 2 400 IU，VE 67.5 mg，VK 1.311 mg，VB11.92 mg，VB29.6 mg，VB521.60 mg，VB329.451 mg，VB62.675 mg，生物素 biotin 0.084 mg，叶酸 folic acid 72.01 mg，VB120.036 mg，Cu 63.959 mg，Fe 85.682 mg，Zn 124.886 mg，Se 0.5 mg，I 0.7 mg。

2)营养水平为计算值。Nutrient levels were calculated values.

试验期末，各处理随机选2头猪屠宰。分别剪取十二指肠、空肠、回肠5 cm，磷酸盐缓冲液冲洗肠腔，再剪取中间1～2 cm置于10%浓度甲醛溶液中固定。制作石蜡切片，图像分析软件分析、测定绒毛高度、隐窝深度，计算V/C。

1.4数据分析

试验数据经Excel 2007初步整理后，应用SPSS 18.0软件进行单因素方差分析，差异显著者用LSD氏法进行多重比较，以P<0.05作为差异显著性判断标准，数据分析结果以“平均值±标准差”表示。

2结果

2.1试验处理对仔猪生长性能的影响

由表5可知，试验处理对仔猪平均日采食量、平均日增重和腹泻率有影响，对料重比无显著影响(P>0.05)。与去皮豆粕处理相比，发酵豆粕E、发酵豆粕C处理仔猪平均日采食量和平均日增重显著提高(P<0.05)，腹泻率显著下降(P<0.05)。

表5　试验处理对仔猪生长性能的影响Table 5　Impacts of experimental treatments on growth performance of piglets

同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)。下表同。

In the same column, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.2试验处理对仔猪小肠绒毛高度的影响

由表6可知，试验处理对仔猪回肠绒毛高度无显著影响(P>0.05)。与去皮豆粕处理相比，发酵豆粕C处理仔猪十二指肠绒毛高度显著提高(P<0.05)，发酵豆粕E处理则无显著差异(P>0.05)。与动物蛋白处理相比，发酵豆粕E处理仔猪十二指肠绒毛高度显著降低(P<0.05)，发酵豆粕C处理无显著差异(P>0.05)。

表6　试验处理对仔猪小肠绒毛高度的影响Table 6　Impacts of experimental treatments on intestinal villus height of piglets　μm

2.3试验处理对仔猪小肠隐窝深度的影响

由表7可知，去皮豆粕处理仔猪小肠隐窝深度最大，发酵豆粕E、发酵豆粕C处理次之，动物蛋白处理最小。与去皮豆粕处理相比，发酵豆粕E、发酵豆粕C处理仔猪十二指肠、空肠隐窝深度显著下降(P<0.05)，回肠隐窝深度无显著差异(P>0.05)。与动物蛋白处理相比，发酵豆粕E、发酵豆粕C处理仔猪十二指肠隐窝深度显著增加(P<0.05)。

2.4试验处理对仔猪小肠V/C的影响

由表8可知，与去皮豆粕处理相比，发酵豆粕E、发酵豆粕C处理仔猪十二指肠和空肠的V/C均显著升高(P<0.05)，动物蛋白处理仔猪十二指肠、空肠、回肠的V/C均显著升高(P<0.05)。

表7　试验处理对仔猪小肠隐窝深度的影响Table 7　Impacts of experimental treatments on small intestinal crypt depth of piglets　μm

表8　试验处理对小肠V/C的影响Table 8　Impacts of experimental treatments on small intestinal villus height and crypt depth ratio of piglets

3讨论

3.1试验处理对仔猪生长性能的影响

发酵豆粕对仔猪生长性能的影响主要原因包括：一是发酵豆粕中抗营养因子含量减少，抗营养作用减弱，对动物生理机能的危害程度减轻；二是发酵豆粕中小分子蛋白质、肽类和氨基酸等活性物质含量增多，有利于动物机体消化吸收，促进动物生长发育。本试验中，发酵豆粕C处理仔猪平均日采食量和平均日增重分别提高5.06%、5.29%，腹泻率下降19.27%以上，说明发酵豆粕处理有利于改善仔猪的生长性能。

3.2GFC技术分析豆粕中的蛋白质含量

GFC技术是分析蛋白质含量的技术之一，主要是以色谱柱中多孔的凝胶颗粒为介质，以蛋白质样品中分子大小为依据进行洗脱分离。其中，大分子先被洗脱出来，中等的其次，最后洗脱的是小分子物质。被洗脱分离出来的蛋白质经紫外检测器依次检测后，形成色谱峰。经系统积分后，得出各分子量物质含量的百分比。本试验中，去皮豆粕、发酵豆粕E和发酵豆粕C中大分子蛋白质(平均分子量分别约38、37、35 ku)含量分别占79.54%、51.10%、24.27%，肽含量(平均分子量范围分别为372～125 u、572～157 u、601～198 u)分别为2.74%、13.27%、19.28%。2种发酵豆粕中大分子蛋白质含量均低于去皮豆粕，且肽含量都高于去皮豆粕。

3.3试验处理对仔猪小肠绒毛结构的影响

小肠结构和功能的完整性是养分得以有效吸收的前提，绒毛高度、隐窝深度以及二者的比值是衡量小肠机能状态的重要指标。小肠绒毛高度是养分吸收能力的表现，绒毛高度下降说明吸收功能降低[4]；隐窝深度小说明肠道细胞生长状态良好；V/C是小肠机能状态及其消化酶活力的综合体现[5]。幼龄动物的肠道尚未发育健全，饲料中部分大分子蛋白质能以完整形式进入血液和淋巴组织[6]：刺激机体产生免疫球蛋白A(IgA)和免疫球蛋白E(IgE)，并与抗原结合形成抗原-抗体复合物，引起免疫反应，导致免疫损伤[7]，使绒毛高度下降，酶分泌量减少；还能激活免疫效应细胞，巨噬细胞通过分泌细胞因子或直接进攻靶细胞引起肠道组织损伤[8]，造成绒毛萎缩和隐窝深度增加。

植物性蛋白质原料的缺点之一是抗营养因子含量多，如胰蛋白酶抑制因子、植酸、抗原蛋白等，其中以大豆抗原蛋白对幼龄动物肠道损伤程度最重。发酵豆粕能有效改善小肠绒毛结构，且改善效果与发酵豆粕的添加量呈正相关[9]。研究表明，饲喂发酵豆粕的仔猪，其肠绒毛高度可提高2.24%以上，隐窝深度下降13.27%以上[10]。本试验中，与去皮豆粕处理相比，动物蛋白处理小肠绒毛高度提高，隐窝深度下降，V/C增大，说明动物蛋白处理对仔猪小肠绒毛结构有促进作用。而发酵豆粕C处理十二指肠绒毛增高10.96%，隐窝深度下降16.38%，空肠隐窝深度下降20.63%，十二指肠、空肠、回肠V/C分别增高32.05%、31.76%、18.42%；发酵豆粕E处理十二指肠、空肠隐窝深度分别下降13.93%、18.03%，十二指肠、空肠V/C分别增高18.59%、24.71%。可见，发酵豆粕能够提高绒毛高度，降低隐窝深，增加V/C，有效改善仔猪小肠绒毛结构。

4结论

豆粕中大分子蛋白质含量与小肠V/C呈负相关。与去皮豆粕相比，发酵豆粕中大分子蛋白质含量低，肽含量高，能够有效提高小肠绒毛高度，降低隐窝深度，增加V/C，有效改善仔猪小肠绒毛结构。同时，对仔猪的生长性能具有促进作用。

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(责任编辑武海龙)

doi：10.3969/j.issn.1006-267x.2016.07.027

收稿日期：2016-01-17

基金项目：沈阳市预混合饲料生产工艺研究中心建设项目(F13-253-8-00)

作者简介：张露露(1987—)，女，辽宁庄河人，硕士研究生，研究方向为单胃动物营养。E-mail： lulu23422@163.com *通信作者：王昕陟，副教授，硕士生导师，E-mail： xinzwang@163.com

中图分类号：S828

文献标识码：A

文章编号：1006-267X(2016)07-2213-08

*Corresponding author, associate professor, E-mail: xinzwang@163.com

Effects of Contents of Macromolecular Protein and Peptide in Fermented Soybean on Intestinal Villi Structure of Piglets

ZHANG Lulu1WANG Xinzhi1*LIU Xulong2LYU Qiuwei2YU Heng2

(1. Animal Husbandry and Veterinary College, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866 China;2. Shenyang Boin Feed Limited Company, Shenyang 110141, China)

Abstract:The purpose of this test was to study the effects of contents of macromolecular protein and peptide in fermented soybean meal on the intestinal villi structure of piglets, and analysed the contents of macromolecular protein and peptide by gel filtration. Forty weaned piglets were randomly allotted into 4 treatments: dehulled soybean meal treatment, fermented soybean C treatment, fermented soybean E treatment and animal protein treatment. The experiment lasted for 5 weeks. The results showed as follows: the macromolecular protein content in dehulled soybean meal was about 80%, which in fermented soybean meal was about 50%, even down to 24%; the peptide content in fermented soybean meal was about 19%, which in dehulled soybean meal was 2.7%. Compared with the dehulled soybean meal treatment, the villus height in duodenum of fermented soybean C treatment was significantly increased (P<0.05), the crypt depth in duodenum and jejunum of fermented soybean E treatment and fermented soybean C treatment was significantly decreased (P<0.05), the villus height and crypt depth ratio in duodenum and jejunum of fermented soybean E treatment and fermented soybean C treatment was significantly increased (P<0.05). In conclusion, macromolecular protein content in soybean meal is negatively correlated with small intestinal villus height and crypt depth ratio; fermented soybean meal can be used in weaning piglets diets, and effectively improve the structure of small intestinal villus of weaning piglets.[Chinese Journal of Animal Nutrition, 2016, 28(7)：2213-2220]

Key words:fermented soybean; GFC; intestinal villus structure