不同光量子数蓝光对豚鼠视网膜超微结构的影响①

徐志刚，吕淑慧，杨笑天，张　涤，王玉清

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003)



不同光量子数蓝光对豚鼠视网膜超微结构的影响①

徐志刚，吕淑慧，杨笑天，张涤，王玉清

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003)

摘要：目的：研究不同光量子数蓝光长期间断照射对豚鼠视网膜组织超微结构的影响。方法：将42只普通级英国短毛三色健康雄性豚鼠随即分成A、B、C、D、E、F组，给予不同强度的蓝光照射，光量子数分别为3.0、4.5、6.0、7.5、9.0、12.0μmol·m-2·s-1，20周后对各组豚鼠视网膜组织损伤情况进行电镜检测。结果：各组豚鼠视网膜组织均出现一定程度的超微结构改变，光感受器细胞变性、凋亡速度加快，如萎缩、变薄、溶解、断裂、凝固、空泡增多等，但并未发现某一组的损伤明显重于其他组的情况，也未观察到对蓝光吸收最强的视网膜光感受器细胞损伤程度明显高于其他层面的情况。结论：光量子数低于12μmol·m-2·s-1的蓝光长期间断照射对豚鼠的眼部发育是相对安全的，所造成的轻微损伤可能与幼龄豚鼠视网膜发育不健全有关。

关键词：蓝光；电镜；视网膜；损伤

我国近视发病的最新资料，青少年近视发病率呈逐年上升趋势，小学生近视发病率平均为50%,高三学生近视发病率平均为90%[1]。近年来，针对蓝光照射可抑制“正视化”进程的研究已成为眼科领域的热点，越来越多的实验数据也证实蓝光照射可减缓近视的发生及发展[2]。与此同时，蓝光长时间照射对视网膜损伤作用也引起了人们的关注，蓝光对视网膜组织敏感性最高、穿透力最强、损伤作用最明显[2,3]。因此，在将蓝光应用于近视预防的过程中，如选择对视网膜组织安全、有效的蓝光照射光量子数具有重要的临床意义。本实验应用不同光量子数的的蓝光作为光源，对豚鼠进行间断照射，而后对各组豚鼠的视网膜组织进行电镜观察，期待获得对视网膜组织损伤最小的蓝光照射光量子数或大致范围，给进一步研究蓝光对青少年近视发生发展的抑制作用提供实验依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物及分组：普通级英国短毛三色健康豚鼠42只，体质量90～110g，鼠龄2周，雄性(长春市亿斯实验动物技术有限责任公司)。选取屈光间质透明度好，无明显眼疾个体，采用随机数字表法将豚鼠分为6组，分别为A、B、C、D、E、F组，应用不同光量子数的蓝色光进行照射。

1.1.2仪器：JEM-1200EX型透射电镜(日本电子株式会社)；CM1950型超薄冰冻切片机(德国徕卡公司)；Lumera T型手术显微镜(德国卡尔·蔡司公司)；手术器械(苏州六六医疗器械厂)；蓝光LED灯管(苏州久腾光电科技有限公司)，蓝色LED灯光波峰值为430nm(半波宽为30)；CX-T02型可编程多功能电子定时器(常熟常新电子有限公司)。

1.2方法

1.2.1光照条件设定：光量子数是目前光照实验国际通用的作用标准，选取人眼能够接受的光量子数量来设计实验环境，更利于后期开展临床试验。A、B、C、D、E、F组照射的光量子数分别为3.0、4.5、6.0、7.5、9.0、12.0μmol·m-2·s-1(见图1)。将定时器串联在主线上，调整至12h/12h，每隔12小时自行开关，使每组接受的光照时间一致。

1.2.2光照20周后每组选取2只发育较好的豚鼠，经水合氯醛麻醉后，迅速摘除眼球，在进口显微镜下，沿睫状体平坦部剖开，缓慢去除玻璃体，仔细分离出视网膜组织，平铺于滤纸上，均选取近黄斑区处，切取1. 5mm×3. 0mm长方形小块，PBS漂洗后置于4%戊二醛中前固定4℃过夜，1%锇酸后固定2h，乙醇-丙酮梯度脱水，环氧树脂618包埋剂定向包埋，半薄切片光学显微镜下定位，制成超薄切片，醋酸双氧铀-柠檬酸铅双染法染色，JEM-1200EX 80KV透射电镜观察、摄片。

2结果

光照20周后，各组豚鼠视网膜组织均出现或多或少的超微结构改变，光感受器细胞变性、凋亡速度加快，如萎缩、变薄、溶解、断裂、凝固、空泡增多等。A组内核层细胞浆水肿样变性，核周围间隙增宽，核内染色质凝聚，核仁明显溶解，证实细胞发生了凋亡(见图2)；B组内网层细胞浆内含有大量变性的细胞器，细胞膜破裂，细胞器外溢，超微结构特征不易辨认(见图3)；C组外节膜盘排列清晰规则,分界明显，局部水肿、膜盘增宽、间隙增大，失去正常的板层结构，病变严重处膜盘溶解，相互融合，界限分辨不清(见图4)；D组外核层细胞核明显固缩，核内染色质凝聚，核膜消失(见图5)；E组外节盘膜局部断裂溶解，出现不规则缺损，即“虫咬现象”(见图6)；F组节细胞层细胞空泡化损害，细胞膜局部凹陷、破裂，细胞核溶解，呈新月形边集，细胞器明显减少(见图7)。

图1各组光照场景。 图2A组内核层细胞核周围间隙明显增宽，细胞核溶解(×2000)。图3B组内网层细胞内出现大量的变性细胞(×2000)。图4C组外节膜盘局部溶解，相互融合(×2000)。图5D组内核层细胞核固缩明显，核膜消失(×2000)。图6E组外节盘膜发生不规则缺损，即“虫咬现象”(×2000)。图7F组节细胞细胞膜局部凹陷、破裂，细胞核溶解，呈新月形边集(×2000)。

3讨论

本研究选取三色豚鼠作为研究对象，性格温顺，易于检查，获得数据更准确。豚鼠为二色视动物，视网膜组织存在两种视锥细胞，对蓝光、绿光敏感，并含有黑色素，这些结构与人类相似[4]。人类的视网膜感光细胞含有3种视色素，分别对红、绿、蓝三种颜色光敏感[5]；黑色素主要分布在RPE细胞(黄斑区较多)、睫状体、虹膜以及脉络膜的色素细胞中。黑色素有稳定自由基、防止高能量短波长光引起潜在光毒性、防止光化学损伤等作用。同时，选取430nm的蓝光作为照射光源，与往常光损伤的实验研究所采用广谱蓝光(400～500nm)相符[6]，具有较好的可比性。所以，实验结果可为开展蓝光抑制青少年近视发生发展的临床试验研究提供重要参考依据。

随着对蓝光认识的逐渐加深，可以明确蓝光在视网膜产生图形和色觉的感知和分辨能力，调节生物体内激素分泌，治疗新生儿黄疸，保持动物的昼夜节律，抑制“正视化”进程等方面都发挥着重要积极作用[7～9]。然而，伴随蓝光日益广泛的应用，对蓝光的安全性研究显得格外重要，光化学损伤是光辐射对视网膜细胞和RPE细胞的所造成的主要病变之一。虽然有多个动物实验及体外细胞培养的实验证明了暴露于高强度蓝光后所引起的视网膜组织的光损伤[10～12]，损伤程度与以下多种因素有关，如光谱范围、光量子数、光照持续时间、物种视网膜的组织结构特点等，但长期、慢性、低强度的蓝光辐照是否可对人眼的产生损伤及损伤程度尚未得到证明，本实验结果可弥补这方面的不足。

本课题组已完成并报道的研究中：利用不同光量子数蓝光间断照射20周后，可明显抑制豚鼠的“正视化”发展，观察豚鼠视网膜结构改变(Tunel染色)，各组视网膜组织均出现了一定程度的细胞凋亡，光感受器细胞核凋亡数量略多。视网膜神经节细胞核、双极细胞层及光感受器细胞层均可见未染色、染色质浓缩边缘化、核膜裂解、凋亡小体等凋亡细胞。视网膜高倍镜(×400)视野下凋亡细胞数量，平均约为(6.68±1.78)个，不同光量子数蓝光照射下差异无统计学意义(P>0.05)。

本研究通过电镜检测对各组豚鼠视网膜超微结构改变进行比较，可以了解蓝光照射后豚鼠视网膜组织，尤其是黄斑区感光细胞的细微损伤，对视网膜HE染色检测和Tunel细胞凋亡检测是一个很好的补充。每组标本通过多层面电镜检查，对视网膜内核层、内网状层、节细胞层、感光细胞外节膜盘等组织进行详细观察(图2～7)，经过仔细对比后发现，各组视网膜各层面均可发现轻微程度的病理损伤，可观察到如细胞水肿、变性、萎缩、核周间隙增宽，外节膜盘局部溶解、融合(虫咬现象)等，但并未发现某一组的损伤明显重于其他组的情况，也未观察到对蓝光吸收最强的视网膜光感受器细胞损伤程度明显高于其他层面的情况，这种损伤的存在可能与视网膜细胞“衰老”关系密切。由此可见，光量子数低于12μmol·m-2·s-1的蓝光长期间断照射并未给正常发育中的豚鼠视网膜感光细胞(黄斑区)造成过多的损伤，与前期研究结果相符。

这种损伤也可能与2W龄豚鼠视网膜发育不健全有关, 其视网膜的防御机制尚未发育完全，角膜及晶状体是抵御光视网膜病变的屏障作用尚未完善，视网膜自身抵御光毒性的防御机制尚未形成。所以，日常生活中，婴幼儿也应加强对于强度过高的可见光及短波长蓝光的防护，在此期采取类似蓝光照射的治疗措施应该慎重，并做好相应的保护措施。同时家长应该督促孩子避免长时间的近距离用眼，多进行远眺和参加室外活动[13]。

综上所述，光量子数低于12μmol·m-2·s-1的蓝光照射对幼年豚鼠的眼部发育是相对安全的，并未表现出光照强度越大损伤越重的一般性规律。依据本研究结果可提出一种假设，这种损伤的发生可能与幼龄豚鼠视网膜发育不健全有关，但具体情况尚需进一步的研究加以证实。

参考文献:

[1]李宏，肖胜盈，马利峰.佳木斯地区小学生近视眼发病情况调查[J].黑龙江医药科学，2014,37(3):58-60

[2]Long Q,Chen D,Chu R.Iliumination with monoehromatic long-wavelength light promotes myopic shift and ocular elongation in newborn pigmented guinea pigs[J].Cutan Ocul Toxicol,2009,28:176-180

[3]Wu J,Seregard S,Algvere PV. Photochemical damage of the retina [J].Surv Ophthalmol,2006,51:461-281

[4]Roehlecke C,Schumann U,Ader M,et al.Influence of blue light on photoreceptoes in a live retinal explant system[J].Mol Vis,2011,17:876-884

[5]Rucker FJ,Osorio D.The effects of longitudinal chromatic aberrationand a shift in the peak of the middle.wavelength sensitive cone fundamental on cone contrast[J].Vision Res,2008,48:1929-1939

[6]Weiss AH,Kelly JP,Bisset D,et al.Reduced L-and M-and increased S-cone functions in an infant with thyroid hormone resistance due to mutations in the THRbeta2 gene[J]. Ophthalmic Genet,2012,33(4):187-195

[7]Feng M,Wang XH,Yang XB,et al.Protective effect of saturaled hydrogen saline against blue light-induced retinal damage in rats[J].Int J Ophthalmol ,2012,5:151-157

[8]刘娜,张楠,艾文亭,等.单色LED蓝光照射对健康人昼夜节律的影响[J].中国组织工程研究与临床康复,2009,13:5923-5926

[9]钱一峰,戴锦辉,刘睿,等.短波长单色光对豚鼠眼屈光发育的影响[J].中国实验动物学报，2012,20(5):5-8

[10]Bergeron MJ,Goudey GR,Orkin SH,et a1.Nathan and Oski’s Hematology of Infancy and Childhood.philadelphia[J].Saunders Elsevier,2011:103-145

[11]Roehlecke C,Schumann U,Ader M,et al.Influenee of blue light oil photoreceptors in a live retinal explant system[J].Mol Vis,20l1,17:876-884

[12]Wielgus AR,Collier RJ,Martin E,et al．Blue light induced A2E 0xidation in rat eyes experimental animal model of dry AMD[J].Photochem Photohiol Sci,2010,9:1505-1512

[13]王玉清，白建海，杨笑天，等.青少年长期配戴渐进多焦点镜片对其调节与集合的影响[J].黑龙江医药科学，2010,33(5)：115-116

基金项目：① 1.佳木斯大学重点课题，编号：Sz2013-007；2.黑龙江省卫生厅科研项目，编号：2013251。

作者简介：徐志刚(1976～)男，黑龙江佳木斯人，硕士，主治医师。 通讯作者：王玉清(1966～)女，黑龙江佳木斯人，硕士，主任医师，教授，硕士研究生导师。E-mail:468069508@qq.com。

中图分类号：R774

文献标识码：B

文章编号：1008-0104(2016)04-0086-03

(收稿日期：2016-01-20)