新疆猪毛菜总黄酮含量测定及其抗氧化活性研究

热萨莱提·伊敏　热娜古丽·阿不都热合曼　木合塔尔·吐尔洪*

1.新疆喀什大学化学与环境科学学院，新疆　喀什　844000；2.新疆特色药食用植物资源化学重点实验室，新疆　喀什　844000



新疆猪毛菜总黄酮含量测定及其抗氧化活性研究

热萨莱提·伊敏1,2热娜古丽·阿不都热合曼1,2木合塔尔·吐尔洪1,2*

1.新疆喀什大学化学与环境科学学院，新疆喀什844000；2.新疆特色药食用植物资源化学重点实验室，新疆喀什844000

【摘要】目的：以不同浓度的乙醇为溶剂提取猪毛菜中总黄酮，并考察提取物的抗氧化活性。方法：采用回流法提取猪毛菜中黄酮类化合物，用比色法测定不同浓度的乙醇提取物中总黄酮含量，测定各提取物的抗氧化活性。结果：猪毛菜中黄酮类化合物在25%、50%、75%的乙醇中黄酮提取率分别为24.7、50.6、48.7mg/g。各种提取物均有不同程度的抗氧化活性，且提取物的抗氧化活性与其浓度之间存在一定的量效关系，其中用50%乙醇提取的提取物清除各种自由基活性以及还原力均相对较高。结论：采用50%乙醇回流法提取的猪毛菜总黄酮含量最高，且黄酮类化合物具有较好的抗氧化活性，为猪毛菜野生资源利用和活性成分的开发提供一定的实验依据。

【关键词】猪毛菜；总黄酮；抗氧化

猪毛菜是藜科猪毛菜属植物猪毛菜(SalsolacollinaPall)的全草，是一种维吾尔民间药用植物，其味淡，性凉，具有平肝潜阳、润肠通便之功效。主要治高血压病、头痛、眩晕、失眠、肠燥便秘等病症[1-2]。猪毛菜中含有生物碱、黄酮、糖类、有机酸、甾醇等多种成分。黄酮类化合物属于植物次级代谢产物，广泛存在于自然界各种植物中，具有清除自由基的生物活性[3]以及抗癌﹑防癌﹑消炎﹑清热解毒﹑镇静﹑利尿等作用[4]，作为安全、无毒的天然产物，黄酮类化合物在医学、食品行业、美容保健等领域已备受关注并且已经开始应用[5]。研究分别用25%，50%、75%的乙醇回流提取猪毛菜中的活性物质，采用紫外分光光度法对各提取物中黄酮进行了定性和定量分析，采用常用的几种体外抗氧化体系对不同浓度乙醇提取物的抗氧化活性进行测定分析，为猪毛菜野生资源利用及活性成分的开发提供依据。

1仪器与材料

1.1仪器TU-1990 双光束紫外分光光度计(北京普析通用有限公司)；TA1004N电子天平；HWS24型电热恒温水浴锅(上海恒科技有限公司)、SHZ-3水循环真空泵；RE5298A旋转蒸发器；ZK-82B型真空干燥箱(上海市实验仪器总厂)；SHA-C水浴恒温振荡器(江苏金坛亿通电子有限公司)；80-1型沉淀离心器(上海手术器械厂)。

1.2材料芦丁对照品(批号：0080-9705，中国药品生物制品检定所)；猪毛菜2014年7月采集于新疆疏附县铁日木乡，晾干，粉粹，过40目筛备用。所用试剂均为分析纯。

2方法

2.1提取物的制备称取25g猪毛菜粉末分别加入25%、50%、75%乙醇500ml，回流提取2h，抽滤，滤渣再分别加入25%、50%、75%乙醇375ml，混匀，再次回流提取1.5h，抽滤，滤渣第三次分别加入三种浓度乙醇250ml，混匀，再次回流提取1h，抽滤，合并三次滤液，65℃减压蒸干，备用。

2.2总黄酮含量测定分别取不同提取液供试品1.00ml置25ml容量瓶中，稀释成合适浓度，采用硝酸铝比色法[6]测定，以芦丁为标准品，在510nm波长处测定A值。得回归方程Y=7.3961X+0.0376 (R2=0.9993)。再计算原材料猪毛菜中总黄酮含量，结果见表1。

2.3不同提取液抗氧化活性比较准确称取0.1000g对照品Vc，溶于100ml 50%乙醇中，配制成浓度为1.000mg/ml溶液，并稀释成0.1、0.3、0.5、0.7、0.9mg/ml。再准确称取猪毛菜25%、50%、75%乙醇提取物浸膏0.8000、0.6000、0.6000g，用50%乙醇定容至100ml，分别配置出1.0332、1.3062、1.2105mg/ml的溶液，分别稀释为0.1、0.3、0.5、0.7、0.9mg/ml猪毛菜供试品溶液，供抗氧化活性测定用。

2.3.1对除DPPH自由基活性的测定准确称取39.4mg DPPH 试剂，用无水乙醇溶解，稀释配制成2×10-4mol/L 的溶液。取5 支具塞试管依次向其中各加入0.1、0.3、0.5、0.7、0.9mg/ml猪毛菜供试品溶液及DPPH溶液各2ml，摇匀[8]。反应30min 后在最大吸收波长517nm 处测定吸光度(Ai)，以乙醇替换DPPH其他步骤同上测其吸光度Aj，2mlDPPH和2ml乙醇加入同一个具塞试管其他步骤同上测其吸光度Ao，根据公式①计算猪毛菜黄酮类组分对 DPPH 自由基的清除率，以Vc作为对照品。各个实验组需平行操作 3 次，求其平均值[9]。

I%=[1-(Ai-Aj)/Ao]×100%

①

2.3.2羟基自由基活性的测定取5支具塞试管依次向其中各加入0.1、0.3、0.5、0.7、0.9mg/ml猪毛菜供试品溶液及2×10-4mol/L FeSO4溶液、2×10-4mol/L H2O2、2×10-4mol/l水杨酸各2ml，于37℃水浴震荡反应30min，加热完毕于510nm 波长处分别测定吸光度Ai。蒸馏水代替H2O2其他步骤同上测其吸光度Aj，无水乙醇代替供试品其他步骤同上测其吸光度Ao。根据公式②计算猪毛菜黄酮类组分对羟基自由基的清除率，Vc 作为阳性对照。每个实验组需重复 3 次，求其平均值[10]。

SA%=[ Ao-(Ai-Aj)]/Ao×100%

②

2.3.3超氧阴离子自由基活性的测定精密量取4.5ml0.05 mmol/L Tris-HCl 缓冲液，25℃水浴20min，分别加入不同浓度(0.1～0.9mg/ml)的三种供试品溶液各1.00ml,再分别加入0.40ml 25mmol /L 邻苯三酚溶液，混和均匀，于25℃水浴中反应5min，加入10mmol/L 盐酸溶液1.00ml终止反应，于325nm处测定吸光度值，计算清除率[11]。

清除率%=[ 1-(Ai-Aj) /Ao]×100%

2.3.4还原能力的测定分别量取不同浓度(0.1～0.9mg/ml)的供试品溶液各2.50ml于5支具塞试管中，依次加入pH6.6磷酸缓冲液和1%铁氰化钾溶液各2.50ml，在50℃下恒温反应20min，再加10%三氯乙酸2.50ml后立刻以3000r/min离心10min，取上清液3ml依次加入2.5ml蒸馏水和0.1%的三氯化铁溶液0.50ml充分混合，静置10min后，于700nm处测吸光度值[12]，吸光值来表明还原能力并且A值高的样品表明其还原能力高。每个试样作3次平行测定，取其平均值。

3结果与讨论

3.1猪毛菜不同提取液总黄酮含量从表1中可以看出，猪毛菜不同浓度的乙醇提取物的得率存在差异，其中25%乙醇提取物浸膏得率为20.8%，50%乙醇提取物浸膏得率为24.2%，75%乙醇提取物浸膏得率为23.0%，通过芦丁线性回归方程Y=7.3961X+0.0376 (R2=0.9993)计算出来的黄酮含量分别为24.7、50.6、48.7mg/g。虽然25%乙醇提取物浸膏得率较高，但是，黄酮含量较低，可能在低浓度乙醇中黄酮以外的其他化学物质溶解的多。

表1　猪毛菜不同浓度乙醇提取液中总黄酮含量

3.2猪毛菜不同提取液中黄酮的紫外光谱特性黄酮类化合物都共同C6-C3-C6的特殊结构，紫外光谱在240～280nm范围内出现特征峰和在330～400nm范围内出现特征峰。这两个特征峰分别由A-环苯酰系统和B-环肉桂酰系统生成的[13-14]。猪毛菜提取物的紫外吸收峰如图1 所示，猪毛菜提取物的主要吸收峰为233nm、261nm、332nm。由261nm出现的特征峰可以看出猪毛菜提取物中有A-环苯酰系统，由332nm产生的吸收峰看出猪毛菜提取物有B-环肉桂酰系统，且猪毛菜提取物和标准品芦丁的紫外光谱特征图相似(图2)。

3.3对DPPH 自由基清除活性的测定结果由图3可知，以Vc 为对照，在试验浓度范围内(0.1～0.9mg/ml)，Vc清除DPPH自由基的能力随着浓度的升高不怎么明显，而三种不同乙醇提取液的清除率都呈现增长的趋势，并且浓度在0.1～0.5mg/ml范围内，各供试品对DPPH自由基清除率上升较快，随后趋于平滑。三种提取物清除率分别为:Vc>猪毛菜50%乙醇提取物>猪毛菜75%乙醇提取物>猪毛菜25%乙醇提取物。当浓度为0.9mg/ml时猪毛菜50%乙醇提取物对DPPH自由基的清除率为88.2%，此结果跟Vc较接近，说明野菜猪毛菜提取液有着较好的清除DPPH自由基的能力，可以作为天然抗氧化剂产品。

3.4对羟基自由基清除活性的测定结果从图4可知，在试验浓度范围内(0.1～0.9mg/ml)，随着浓度的增大，以及猪毛菜不同浓度乙醇提取物对羟自由基的清除率都有增长的趋势，而Vc的清除率增长得较快。当浓度在0.15mg/ml左右时，猪毛菜50%、75%乙醇提取物的清除率比Vc高；猪毛菜50%乙醇提取物和Vc的浓度为0.25mg/ml时，对羟自由基的清除率分别达到54.6%、57.3%，随着试验样品浓度继续升高，清除羟自由基能力大小分别为：Vc>猪毛菜50%乙醇提取物>猪毛菜75%乙醇提取物>猪毛菜25%乙醇提取物。当浓度达到0.9mg/ml时，猪毛菜50%、75%乙醇提取物对羟自由基的也具有较好的清除能力，清除率分别为80.9%、76.3%。

3.5对超氧阴离子自由基清除活性的测定结果从图5可知，在试验所测定浓度范围内，三种供试品对超氧阴离子自由基的清除率都较低且达不到Vc的清除率。清除率大小顺序为：Vc>猪毛菜50%乙醇提取物>猪毛菜75%乙醇提取物> 猪毛菜25%乙醇提取物。其中Vc 在试验浓度范围内，上升趋势较快，并且在浓度达到0.9mg/ml时，Vc对超氧阴离子自由基的清除率已经达到93.8%；三种不同浓度乙醇提取液中，50%乙醇提取液的抑制率稍微高些，但是只有39.9%，因此猪毛菜对超氧阴离子自由基虽有一定的清除作用，但都较弱。

3.6还原力测定从图6可知，供试品在给定浓度范围内的还原能力大小顺序为：Vc>猪毛菜50%乙醇提取物>猪毛菜25%乙醇提取物>猪毛菜75%乙醇提取物。Vc还原力随着浓度的增加而明显增大，在浓度为0.5mg/ml时，其还原能力达到1.75；猪毛菜不同浓度乙醇提取物的还原力与浓度存在量效关系，但还原能力一般，在浓度为0.9mg/ml时，猪毛菜的25%、50%、75%的乙醇提取物的还原力分别为0.521、0.278、0.217。

4结论

猪毛菜不同浓度的乙醇提取物的得率存在差异，其中25%乙醇提取物浸膏得率为20.8%，50%乙醇提取物浸膏得率为24.2%，75%乙醇提取物浸膏得率为23.0%，黄酮含量分别为24.7、50.6、48.7mg/g。供试品含有总黄酮含量与其抗氧化活性与之间存在一定的关系。研究对量与效率之间的定量关系没进行系统性研究，但从实验结果可知，猪毛菜不同浓度的乙醇提取物的抗氧化活性与黄酮类化合物的总含量有着较密切的关系，黄酮类化合物含量越高的提取物抗氧化活性也就越强。其中用50%乙醇提取的提取物清除以上三种自由基活性以及还原力都较高，猪毛菜总黄酮的提取及抗氧化活性的研究为提高猪毛菜野生资源利用和活性成分的开发提供一定的依据。

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基金项目：自治区高校科研计划青年教师科研启动基金(XJEDU2014S055)。

作者简介：热萨莱提·伊敏(1985-)，女，新疆喀什人，硕士研究生，主要从事天然产物分析。 通信作者：木合塔尔·吐尔洪，男，新疆喀什人，教授，主要从事天然产物有效成分分析。E-mail:tumut@sohu.com

【中图分类号】R284.1

【文献标志码】A

【文章编号】1007-8517(2016)12-0014-03

(收稿日期：2016.04.21)

Contents of total flavonoids and antioxidant activity ofSalsolacollina

Resalat EMIN1,2Renagul ABDURAHMAN1,2Mheta′er Tu′erhong1,2*

1. Chemistry and Environmental Science College, Kashgar University,Kashgar 844007,China；2. Laboratory of Xinjiang Native Medicinal and Edible Plant Resources Chemistry, Kashgar 844007 , China

Abstract:With different concentrations of ethanol as extraction agent, the total flavonoid compounds in Salsola were extracted by refluxing method,and the content of total flavonoids in the ethanol extract with different concentration were determined by colorimetry，and the antioxidant activity were tested. The results showed that, the flavonoids in Salsola in 25%, 50%, 75% ethanol extraction rate were 24.7mg/g,50.6mg/g,48.7mg/g respectively. And 50% ethanol extracts exhibited the highest activity in removing DPPH free radicals hydroxyl free radicals and superoxide anion as well as the highest reducing capacity. Studying on extraction and antioxidant activity of total flavonoids of Salsola can improve the development of China′s wildlife resources and utilization of active ingredients.

Key words:Salsola collina；total flavonoids；antioxidant activity