染色体9P21多态性与大动脉粥样硬化型脑梗死的相关性☆

张婷许宏伟石志鸿纪勇

染色体9P21多态性与大动脉粥样硬化型脑梗死的相关性☆

张婷*许宏伟△石志鸿*纪勇*

目的探讨染色体9p21的rs7049105、rs647188、rs1333035位点与湖南长沙汉族人群大动脉粥样硬化型脑梗死（large-artery atherosclerosis stroke，LAS）的相关性，并研究这3个位点在有头颈部动脉粥样硬化证据的人群中与LAS的相关性。方法收集湖南长沙汉族人群中229例LAS患者为病例组，同期门诊及体检中心“健康”人群中233例为对照组1，其中有动脉粥样硬化证据的对照150例（64.38%）纳入对照组2，无动脉粥样硬化证据的对照83例（35.62%）纳入对照组3。利用基质辅助激光解析飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）方法对样本进行基因分型检测。结果rs647188位点在湖南长沙汉族人群中可能不存在多态性；病例组与对照组1间、病例组与对照组3间rs7049105和rs1333035位点及病例组与对照组2间rs7049105位点的多态性分布比较未发现统计学差异（P＞0.05）。病例组与对照组2间rs1333035位点的基因型频率分布比较发现有统计学差异（χ2=6.502，P= 0.039）。结论染色体9p21的rs10757274、rs7049105多态性与湖南长沙地区汉族人群LAS可能不相关，在湖南长沙汉族人群中rs647188位点可能不存在多态性，rs1333035位点多态性可能与启动斑块破裂及血栓栓塞相关。

9p21大动脉粥样硬化型脑梗死 多态性

【Abstract】Objective To explore the association between rs7049105，rs647188，rs1333035 of chromosome 9p21 and the LAS among Chinese Han population of Changsha；to explore the association between rs7049105，rs647188，rs1333035 and the LAS among patients with evidence of cephalic and cervical vessel atherosclerosis.Methods The present study comprised 229 LAS patients and 233 healthy controls.The 233 controls which we defined control group 1.In the controls，150 （64.38%）controls with evidence of atherosclerosis were defined as control group 2，83（35.62%）controls without evidence of atherosclerosis were defined as control group 3.The sample genotyping was detected using MALDI-TOF-MS.Results There was no polymorphism of rs647188 among case group and control group 1.There was no significant difference in the polymorphism distribution of rs7049105 and rs1333035 between the case group and control group 1 and 3（P＞0.05）.There may be no significant different in the polymorphism distribution of rs7049105 between the case group and control group 2. The rs1333035 was associated with risk of LAS among patients with evidence of cephalic and cervical vessel atherosclerosis （χ2=6.502，P=0.039）.Conclusions The rs10757274 and rs7049105 polymorphism in the chromosome 9p21 may not be associated with risk of LAS among Han population of Changsha.There may be no polymorphism of rs647188 among Han populationof Changsha.The rs1333035polymorphism may be associatedwithplaque rupture andthrombosis.

【Key words】9p21 Large-artery atherosclerosis stroke Polymorphism

脑梗死是一种复杂的多基因疾病，发现疾病的致病基因或位点，可以为诊断及治疗该病提供靶点。在染色体9p21中，9p21.3是到目前为止与冠心病相关性最为显著的区域［1-3］。2012年METASTROKE协作组通过对多个GWAS进行Meta分析验证了9p21.3也与LAS存在相关性（p=3.32× 10-5）［4］，在9p21.3上游距离约80kb的一个区域有许多连锁不平衡（linkage disequilibrium，LD）的SNP位点，在一些研究中该区域被命名为1号单倍型区域［5-6］。2013年，FAN等［6］在4000多例高加索人样本中验证了9p21染色体1号单倍型与心肌梗死显著相关。目前国内外对于9p21的1号单倍型区域位点与LAS的相关性研究尚未见报道。故本研究拟在湖南长沙汉族人群中研究1号单倍型区域上下游共约36kb范围内的3个标签SNP（rs7049105、rs647188、rs1333035）与LAS的相关性。并通过参照Fan［6］的研究方法，在对照组中根据有无头颈部动脉粥样硬化证据进行分组，在有头颈部动脉粥样硬化证据的人群中比较发生了LAS的患者与未发生LAS的患者间这3个位点的多态性分布，以期了解1号单倍型区域的SNP是否会提高有头颈部动脉粥样硬化证据的人群发生LAS的风险。

1　对象与方法

1.1研究对象

1.1.1病例组选择标准 收集2012年2月至2013 年12月期间湘雅医院神经内科住院的LAS患者229例为病例组，其中男125例，女104例，年龄从44岁～86岁，平均年龄（59.36±11.15）岁。入组标准：①祖籍湖南长沙地区；②汉族人；③符合中国急性缺血性脑卒中诊治指南2010中缺血性脑卒中的诊断［7］；④收集患者颈部血管彩超、经颅多普勒超声、磁共振血管造影（magnetic resonance angiography，MRA）、计算机断层成像血管造影（computed tomography angiography，CTA）或数字减影血管造影 （digital subtraction angiography，DSA）报告提示存在头颈部动脉粥样硬化病变证据；⑤按照韩国改良-TOAST病因分型标准［8］纳入LAS患者。排除标准：①有严重心、肝、肺、肾功能不全患者；②心源性栓塞型；③小动脉闭塞型；④其他明确原因（如高凝状态、血液系统疾病、血管炎、动脉夹层、烟雾病等）；⑤不明原因型（同时存在有多个导致中风的因素，例如同时有大动脉粥样硬化和心源性栓塞风险；没发现明显的能导致中风的病因学证据；由于不完善的检查导致无法分类的卒中）。

1.1.2对照组选择标准 对照组选自同期湘雅医院门诊及体检中心的祖籍湖南长沙地区的“健康”汉族人群，共233例。入组标准：①祖籍湖南长沙地区；②汉族人；③无神经系统疾病病史；④询问收集每位入组者的头颈部血管影像学资料，并且对无头颈部血管影像学资料的患者行颈部血管彩超检查。排除标准：有严重心、肝、肺、肾功能不全患者。

将对照组分为3组：对照组1：有或无头颈部动脉粥样硬化证据的对照，共233例；对照组2：从对照组1中筛选有头颈部动脉粥样硬化证据的对照，共150例；对照组3：从对照组1中筛选无头颈部动脉粥样硬化证据的对照，共83例。

所有受试者均经知情同意，并经中南大学湘雅医院医学研究伦理委员会批准。

1.2研究方法

1.2.1标签SNP（tagging SNP，tagSNP）的选择 本研究采用HapMap CHB数据库，数据来源为Hap-Map Data Rel 24/PhaseII，Nov08，on NCBI B36 assembly，dbSNP b126，运用Haploview软件选择tag SNP，在长度约11kb的1号单倍型（物理位置22019129-22031005）上下游各10kb的空间范围（物理位置22004129-22041006，共36kb）内筛选tagSNP，最终纳入符合条件的rs7049105、rs647188、rs1333035位点。

1.2.2提取DNA及基因分型方法 采取受试者晨起空腹静脉血5 mL，采用经典的酚氯仿法提取基因组DNA，-20°分装保存，由上海邃志生物科技有限公司采用基质辅助激光解析飞行时间质谱方法（MALDI-TOF-MS）进行基因分型。

1.2.3统计学处理 应用统计学软件SPSS17.0对数据进行分析，计量资料比较用t检验，计数资料比较用χ2检验。采用Hardy-Weinberg平衡在线检测（http：//ihg.gsf.de/cgi-bin/hw/hwa1.pl）对样本进行HWE检验。检验水准α=0.05。

2　结果

2.1一般特点 总样本量为462例，病例组和对照组1的一般特点见表1。两组间在性别、年龄、吸烟史、饮酒史上无统计学差异（P＞0.05），而在BMI、高血压、糖尿病病史这些方面有统计学差异（P＜0.05）。

表1一般特点

2.2染色体9p21多态性研究

2.2.1 3个SNP位点的HWE检验 rs647188位点由于基因分型结果显示其等位基因均为A，故不必进行HWE检验。rs7049105、rs1333035均符合HWE平衡定律（P＞0.05）。

2.2.2病例组与对照组1的位点多态性分布比较rs7049105病例组分型成功228例样本，对照组1分型成功232例样本，基因型以GG型最为常见，等位基因以G最为常见；rs1333035病例组分型成功213例样本，对照组1分型成功210例样本；基因型以TT型最为常见，等位基因频率以T最为常见。结果显示：各个基因型及等位基因频率分布在两组间不存在统计学差异（P＞0.05）。

2.2.3病例组与对照组2的位点多态性分布比较本研究在对照组1中筛选出了1组有动脉粥样硬化证据的对照组2。病例组加对照组2人群可以代表有头颈部动脉粥样硬化证据的人群。对照组2共有150例，rs704910、rs1333035位点分别分型成功150例、135例样本。结果显示：rs1333035位点的基因型频率在病例组和对照组2间差别有统计学意义（P=0.039）（见表2）。

表2 rs7049105和rs1333035位点的多态性分布

2.2.4病例组与对照组3 rs7049105和rs1333035位点的多态性分布比较 对照组3为无动脉粥样硬化型证据的人群，共有 83例，rs7049105、rs1333035位点分别分型成功82、75例样本。结果显示各个基因型及等位基因频率分布在两组间不存在统计学差异（P＞0.05）。

3　讨论

染色体9p21与常见的心血管病危险因素（如高血压病、高血脂）缺乏关联性，说明9p21有可能是通过某种全新的机制导致疾病的发生［9-10］，2010年，MUSUNURU等［5］作者发现染色体9p21与血小板聚集的增加存在相关性。而且该研究发现与血小板活性相关性最为显著的SNP位于1号单倍型区域。1号单倍型区域的风险等位基因可能通过调节血小板的活性增加了斑块的易损及血栓栓塞，从而导致存在动脉粥样硬化的人群发生心肌梗死与LAS。

在LAS中，常见的发病机制为原位动脉粥样硬化血栓形成及动脉到动脉栓塞［11］，前文中提到1号单倍型可能与斑块破裂及血栓栓塞相关，国内有研究也发现某位点与脑梗死相关但并不与脑动脉狭窄相关，可能也是参与了斑块破裂及血栓栓塞这一过程［12］。故在本次研究中，“原位动脉粥样硬化血栓形成”在研究1号单倍型与LAS的相关性时便是一个混杂因素，因此我们通过设计对照组2，即有动脉粥样硬化证据的对照组来匹配病例组与对照组，并增加了对照组样本的同质性，该实验设计方法在REILLY［13］的研究中也有采用。结果发现，在病例组与对照组2的基因型频率比较中，rs1333035位点在两组间具有统计学差别（P＜0.05）。rs1333035等位基因频率比较未发现显著差异，原因可能是某个核苷酸突变单独存在时并不起作用，只有它处于纯合或者杂合状态时才与疾病相关［14］。

与对照组2比较的结论表明rs1333035位点与启动斑块破裂及血栓栓塞可能相关，与对照组3比较的结论表明rs1333035与头颈部动脉粥样硬化斑块的存在及原位沉积可能并无相关性，而病例组与对照组1比较的结论并未发现rs1333035位点与LAS有相关性，但这正有可能是未匹配混杂因素而掩盖了其相关性。

FAN等［6］的研究总样本量达到4000多例，共在9p21检测了24个位点，分别以单倍型的形式论证了9p21.3与冠心病显著相关，1号单倍型与在心肌梗死的患者显著相关。本研究的缺陷在于样本量有限，且仅得到了单个位点的阳性结果，而在复杂性疾病的研究中，由多个变异位点所组成的单倍型分析比单个位点更有说服力。此外，在本次研究中rs1333035位点的基因分型成功率只有91.56%，这也成为了一个混杂因素。

综上所述，rs647188可能在湖南长沙地区汉族人群中不存在多态性，rs7049105位点可能与LAS不具有相关性，rs1333035可能与启动斑块破裂及血栓栓塞有相关性，目前关于9p21对LAS的致病作用机制仍不明确，但很可能与影响血小板聚集相关，rs1333035位点与LAS的相关性研究在国内外尚未见报告，故进一步的大样本量基因多态性研究及功能研究仍是十分必要的。

［1］HINOHARA K，NAKAJIMA T，TAKAHASHI M，et al.Replication of the association between a chromosome 9p21 polymorphism and coronary artery disease in Japanese and Korean populations［J］.J Hum Genet，2008，53（4）：357-359.

［2］SCHUNKERT H，GOTZ A，BRAUND P，et al.Repeated replication and a prospective meta-analysis of the association between chromosome 9p21.3 and coronary artery disease［J］.Circulation， 2008，117（13）：1675-1684.

［3］LI SJ，HUWL，LIU DT，et al.MTAP gene is associated with ischemic stroke in Chinese Hans［J］.J Neurol Sci，2009，284 （1-2）：103-107.

［4］TRAYLOR M，FARRALL M，HOLLIDAY EG，et al.Genetic risk factors for ischaemic stroke and its subtypes（the METASTROKE collaboration）：a meta-analysis of genome-wide association studies［J］.Lancet Neurol，2012，11（11）：951-962.

［5］MUSUNURU K，POST WS，HERZOG W，et al.Association of single nucleotide polymorphisms on chromosome 9p21.3 with platelet reactivity：a potential mechanism for increased vascular disease［J］.Circ Cardiovasc Genet，2010，3（5）：445-453.

［6］FAN M，DANDONA S，MCPHERSON R，et al.Two chromosome 9p21 haplotype blocks distinguish between coronary artery disease and myocardial infarction risk［J］.Circ Cardiovasc Genet，2013，6（4）：372-380.

［7中华医学会神经病学分会脑血管病学组急性缺血性脑卒中诊治指南撰写组.中国急性缺血性脑卒中诊治指南2010 ［J］.中华神经科杂志，2010，43（2）：146-153.

［8］HAN SW，KIM SH，LEE JY，et al.A new subtype classification of ischemic stroke based on treatment and etiologic mechanism ［J］.Eur Neurol，2007，57（2）：96-102.

［9］SAMANI NJ，ERDMANN J，HALL AS，et al.Genomewide association analysis of coronary artery disease［J］.N Engl J Med，2007，357（5）：443-453.

［10］MCPHERSON R，PERTSEMLIDIS A，KAVASLAR N，et al.A common allele on chromosome 9 associated with coronary heart disease［J］.Science，2007，316（5830）：1488-1491.

［11董强，黄家星，黄一宁，等.症状性动脉粥样硬化性颅内动脉狭窄中国专家共识［J］.中国神经精神疾病杂志，2012（03）：129-145.

［12曹裕民，张雄，龙隆，等.血小板活化因子乙酰水解酶基因多态性与脑动脉粥样硬化性狭窄的关联性研究［J］.中国神经精神疾病杂志，2014（03）：138-142.

［13］REILLY MP，LI M，HE J，et al.Identification of ADAMTS7 as a novel locus for coronary atherosclerosis and association of ABO with myocardial infarction in the presence of coronary atherosclerosis：two genome-wide association studies［J］.Lancet，2011，377（9763）：383-392.

［14杨剑，哈木拉提·吾甫尔，李风森，等.新疆维吾尔族哮喘患者IL-13基因2100A/G突变位点多态性研究［J］.重庆医学，2013（14）：1575-1577.

（责任编辑：李立）

Association between chromosome 9p21 polymorphism and the large-artery atherosclerosis stroke.

ZHANG Ting，XU Hongwei，SHI Zhihong，JI Yong.HuanHu Hospital，Tianjin，300060，China.Tel：022-60367885.

R743

A

10.3969/j.issn.1002-0152.2016.02.008
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△中南大学湘雅医院

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2015-07-23）