帕金森病患者外周血单核细胞CD14和TLR4中mRNA的表达水平☆

王玲玲陈思马俊许巍岳涛赵振向王剑锋王晓棠刘艺鸣

帕金森病患者外周血单核细胞CD14和TLR4中mRNA的表达水平☆

王玲玲*陈思*马俊*许巍*岳涛*赵振向*王剑锋*王晓棠*刘艺鸣*

目的 研究帕金森病患者外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）脂多糖受体（cluster of differentiation 14，CD14）和toll样受体4（toll-like receptor 4，TLR4）中mRNA的表达并探讨其在疾病发生发展中的临床意义。方法本实验共入组44例帕金森病患者和37例性别、年龄相匹配的健康对照者，并详细记录入组的44例帕金森病患者发病年龄、病程、性别，在关期时对帕金森病患者进行H-Y分期、UPDRSⅡ、UPDRSⅢ、NMSS评分，利用RT-PCR技术检测各研究对象PBMC中CD14和TLR4中mRNA的表达。结果 帕金森病患者外周血CD14 mRNA表达水平（1.459±0.658）2-△△CT、TLR4 mRNA（1.408±0.698）2-△△CT表达较健康对照者（（1.162±0.631）2-△△CT、（1.122±0.557）2-△△CT）均显著增加（P均＜0.05）。相关性分析显示帕金森病组CD14 mRNA的表达水平与反应帕金森病疾病严重程度的H-Y分期呈显著正相关（P＜0.05）。结论帕金森病患者外周血CD14 mRNA表达与其H-Y分期正相关，提示CD14/TLR4的单核细胞所介导的固有免疫反应可能是帕金森病发生、发展的一个重要因素。

帕金森病单核细胞信使RNA TLR4

【Abstract】Objective To investigate the expression levels of the CD14 mRNA and TLR4 mRNA in peripheral blood mononuclear cells from patients with Parkinson disease and to explore the clinical signicance.Methods Forty-four patients with Parkinson disease and 37 healthy controls were recruited.We recorded age of onset，duration of illness and sex of all recruited patients.PD patients were evaulated using the Hoehn-Yahr stages，Unified Parkinson Disease Rating Scale（UPDRS）Ⅱand UPDRSⅢ，non-motor symptoms scale（NMSS）on“off”time.Reverse transcription-polymerase chain reaction was performed to determine the expression levels of CD14 mRNA and toll-like receptor 4 （TLR4）mRNA.Results The expression levels of CD14 mRNA（1.459±0.658）2-△△CTand TLR4 mRNA（1.408±0.698）2-△△CTwas significantly up-regulated（P＜0.05）in Parkinson disease compared with controls（1.162±0.631）2-△△CT、（1.122± 0.557）2-△△CT）.In addition，there was positive correlation between the expression levels of CD14 mRNA in Parkinson disease patients with the Hoehn-Yahr stages.Meanwhile，there was no significant correlation between the expression levels of CD14 mRNA and TLR4 mRNA with other clinical scores.Conclusions There is positive correlation between the expression levels of CD14 mRNA in Parkinson disease patients with the Hoehn-Yahr stages，indicating that CD14/TLR4positive monocyte may be involved in the pathogenesis of the Parkinson disease.

【Key words】Parkinson disease Monocytes RNA Messenger TLR4

帕金森病（Parkinson disease，PD）是常见的神经系统变性疾病［1］，临床表现除典型的运动症状外，常伴有便秘、抑郁、感觉异常等非运动症状，其发病机制至今仍不十分明确。PD的病因很多，包括遗传因素、环境因素、年龄老化、氧化应激、免疫炎症等，免疫炎症因素近来受到更多的关注。

尽管目前对PD的中枢免疫炎性机制的研究较多［2-4］，但关于PD的外周固有免疫的研究较少。单核细胞是外周固有免疫应答的重要组成部分，本实验旨在探讨PD外周血单核细胞中CD14和TLR4mRNA的表达水平及其与PD的临床评分的相关性，并探讨免疫异常在PD发生、发展中的作用。

1　对象与方法

1.1研究对象 随机选取2014年11月至2015年5月于山东大学齐鲁医院神经内科门诊和病房就诊的原发性PD患者44例。PD的诊断标准采用中华医学会神经病学分会运动障碍及帕金森病学组［5］制定的帕金森病诊断标准：（一）诊断帕金森病 1.运动减少；2.至少存在下列1项特征：①肌肉强直；②静止性震颤（4～6Hz）；③姿势不稳。（二）必须排除非帕金森病①反复的脑卒中发作史，伴帕金森病特征的阶梯式进展；②反复的脑损伤史；③明确的脑炎和非药物所致动眼危象；④在症状出现时，正在接受神经安定剂治疗和多巴胺耗竭剂；⑤1个以上的亲属患病；⑥病情持续缓解或发展迅速；⑦发病3年后，仍是严格的单侧受累；⑧CT扫描可见颅内肿瘤或交通性脑积水；⑨用大剂量左旋多巴治疗无效（除外吸收障碍）；⑩出现其他神经系统症状和体征。（三）支持诊断帕金森病必须具备下列3项或3项以上的特征①单侧起病；②静止性震颤；③逐渐进展；④发病后多为持续性的不对称性受累；⑤对左旋多巴的治疗反应非常好（70%～100%）；⑥临床病程10年以上（含10年）；⑦左旋多巴导致的严重的异动症；⑧左旋多巴的治疗效果持续5年以上（含5年）。排除标准：①合并有心肝肾功能不全者；②合并有恶性肿瘤者；③近期有感染或服用免疫相关制剂；④合并有自身免疫性疾病者；⑤认知功能障碍。37例健康对照者均来自健康体检中心，性别年龄与PD患者相匹配，且实验室检查结果均正常。所有PD患者及健康对照者严格排除感染、局部炎症反应等不良影响，所有入组成员入组时近期均无感染，均无自身免疫疾病病史。本实验通过山东大学齐鲁医院伦理委员会批准，且所有的研究对象均知情且签署知情同意书。44例PD患者中女20例，男24例；年龄40～72岁（57.046±9.376），病程1～10年（6.216±2.792）；37例健康对照者中女性18例，男性19例；年龄42～73岁（56.811±6.859）。PD组与健康对照组一般临床资料无统计学差异。

1.2研究方法

1.2.1临床资料收集 所有入组的PD患者均由神经内科医师详细地询问病史，并记录性别、发病年龄、病程，并在关期时对PD患者进行H-Y分期、UPDRSⅡ、UPDRSⅢ、NMSS评分。所有的研究对象均进行MMSE评分。

1.2.2提取PBMC中的RNA每个研究对象均抽取空腹服药前的肘静脉血4 mL，并用淋巴细胞分离管分离提取PBMC，加入1 mL trizol（invitrogen）混匀后提取RNA。

1.2.3逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）检 测CD14 mRNA和TLR4 mRNA运用RT-PCR方法，按照Prime ScriptTMRT（TaRaKa公司）的说明书进行逆转录反应得到cDNA，按照PCR说明书（TaRa-Ka公司）进行PCR反应，反应结束后以SDS 3.3软件分析其ct值及计算相对表达量（relative quantity，RQ），RQ=2-△△CT。

1.3统计学方法 所有数据均以（x±s）表示，各组间外周血CD14 mRNA、TLR4 mRNA表达水平的比较用两独立样本的t检验，相关性分析用Spearson和Pearson相关分析。所有数据使用SPSS 19.0进行统计分析，检验水准α=0.05。

2　结果

2.1 一般临床资料 本实验共纳入44例PD患者和37性别年龄相匹配的健康对照者。PD组患者的性别、年龄和MMSE评分与健康对照组相比，两组病例资料无显著统计学差异（χ2=0.082，P=0.75；t=-0.13，P=0.897；t=-0.575，P=0.567），见表1。44例PD患者按H-Y分期分为4组，H-Y分期为2分组6例，H-Y分期为2.5分组15例，H-Y分期为3分组17例，H-Y分期为4分组6例。

2.2 CD14 mRNA和TLR4 mRNA的表达水平PD组的CD14 mRNA、TLR4 mRNA的表达水平均显著高于对照组（t=-2.061，P=0.043；t=-2.011，P= 0.048），两组间CD14 mRNA、TLR4 mRNA的表达水平有统计学差异（P均＜0.05）（见表2）。CD14 mRNA、TLR4 mRNA的熔解曲线（见图1）。

图1 CD14 mRNA、TLR4 mRNA及内参照GAPDH的熔解曲线

2.3 CD14 mRNA和TLR4 mRNA的表达水平与UPDRSⅡ、UPDRSⅢ、NMSS评分及H-Y分期的相关性统计结果显示，CD14 mRNA的表达水平与H-Y分期均呈显著正相关（r=0.315，P=0.038），TLR4 mRNA的表达水平与H-Y分期不相关（r= 0.258，P=0.091）（见表3）；PD组内CD14 mRNA和TLR4 mRNA的表达与UPDRSⅡ（r=0.03，P=0.845；r=-0.161，P=0.296）、UPDRSⅢ（r=-0.019，P=0.901；r=-0.054，P=0.726）、NMSS（r=0.09，P=0.56； r=-0.143，P=0.353）均不存在相关性。

表1一般临床资料

表2 CD14 mRNA和TLR4 mRNA的表达水平

表3 CD14 mRNA、TLR4 mRNA的表达水平与H-Y分期的相关性分析

2.4不同发病年龄和病程的PD患者CD14 mRNA 和TLR4 mRNA表达水平比较 PD组按发病年龄是否超过50岁分为2组，发病年龄不超过50岁组（≤50岁）21例，发病年龄超过50岁组（＞50岁）23例，两组CD14 mRNA和TLR4 mRNA的表达水平无统计学差异（t=0.684，P=0.498；t=1.56，P=0.126）；按病程是否超过5年分为2组，病程不超过5年组（≤5年）19例，病程超过5年组（＞5年）25例，两组CD14 mRNA和TLR4 mRNA的表达水平无显著差异（t=-0.157，P=0.876；t=0.044，P=0.965）。

3　讨论

固有免疫是机体防御病原微生物入侵的第一道防线，其参与PD的致病于1988年由McGeer等［6］发现的。但PD固有免疫方面的研究大部分与中枢神经系统相关［2，7-8］，外周固有免疫方面的研究较少。

CD14主要在单核巨噬细胞表达，TLR4在髓源性细胞（如单核巨噬细胞）上表达［9］，CD14/TLR4协同作用，能识别革兰阴性杆菌脂多糖，通过激活下游一系列信号通路参与固有免疫应答［10-11］。FUNK等［12］研究发现，PD患者外周血单核细胞前体细胞较健康对照者增多，但单核细胞占外周血白细胞总数的比例与健康对照者无明显差异；PD患者经典型单核细胞的单核细胞趋化因子受体CCR2表达较健康对照者增多，这提示PD患者的单核细胞可能存在调节异常。

研究发现，PD患者脑脊液中单核细胞CD14的前体的可溶性形式增多［13］，新近动物实验结果也证实PD小鼠模型脑内的CD14表达增多［14］。PD患者脑脊液标本获取困难，寻找PD患者外周血单核细胞CD14的表达与PD发生发展过的关系及CD14在外周血中的作用机制有重要的临床意义。GROZDANOV等［15］近来研究发现，与健康对照者相比，帕金森患者外周血的单核细胞总数无显著差异，但CD14+单核细胞的所占的比例较大；分离培养帕金森患者的单核细胞，对脂多糖刺激表现为过度激活状态，且其过度激活的程度与PD的严重程度相关。本实验结果显示，PD患者的CD14 mRNA表达较健康对照者增加，且与关期时的H-Y分期呈显著正相关，而H-Y分期能评估PD病情进展程度，这与GROZDANOV等的研究结果一致，这提示CD14阳性的单核细胞可能在PD的发生、进展过程起重要作用。本实验还发现，CD14 mRNA的表达与关期时的UPDRSⅡ、UPDRSⅢ、NMSS均无相关性，这可能是由于UPDRS 及NMSS评分是对PD症状学严重程度的提示，这与PD患者临床症状表现多样有关，不能准确提示PD病情的严重程度，因此说明CD14 mRNA的表达与可能与PD症状学严重程度无明显相关性。

TLR4是固有免疫的病原体相关分子模式的受体，单核细胞是机体参与外周固有免疫应答的重要细胞之一，ZHANG等［16］发现阿尔茨海默病患者外周血中的T LR4 mRNA表达增多，且TLR4 mRNA的表达与MMSE评分呈负相关，DROUIN等［17］对帕金森患者外周血的研究发现，中间型单核细胞和B淋巴细胞TLR4表达明显增加，经典型单核细胞TLR4有表达增加的可能性，T淋巴细胞的表达与正常人相比没有显著差异。本实验结果显示，PD患者的TLR4 mRNA的表达较健康对照者显著增加，提示TLR4可能参与PD的致病过程。另外，本实验还发现了PD患者外周血TLR4的表达与关期时的H-Y分期不正相关，且外周血标本易于获得，这提示我们TLR4可能参与PD病情的发生发展，可以考虑用于评估PD患者的病情。

本实验还将PD患者按发病年龄、病程进行分组，比较各组间CD14 mRNA、TLR4 mRNA的表达，结果显示各组间均无统计学差异，本实验入组标准严格，样本量小，其表达与发病年龄、病程等因素无关的实验结果尚需进一步的探讨。

固有免疫激活及其诱导的炎症反应在PD的发生发展过程中起重要作用［2，7］。本实验发现帕金森患者的单个核细胞CD14mRNA和TLR4 mRNA表达增多，且CD14mRNA与疾病的严重程度有相关性，但本研究未对外周血中的单个核细胞进一步分类，亦未涉及到CD14/TLR4激活的下游信号通路的变化，有待于在以后的实验中深入研究。

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（责任编辑：李立）

Expressions of CD14 mRNA and TLR4 mRNA in peripheral blood mononuclear cells in patients with Par-kinson disease.

WANG Lingling，CHEN Si，MA Jun，XU Wei，YUE Tao，ZHAO Zhenxiang，WANG Jianfeng，WANG Xiaotang，LIU Yiming.Department of neurology，Qilu Hospital of Shandong University，Jinan 250012，China.Tel：0531-82169114.

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A

10.3969/j.issn.1002-0152.2016.02.009
☆山东省科技攻关项目（编号：2014GSF118024）
*山东大学齐鲁医院神经内科（济南250012）

（E-mail：amyliu831@163.com）

2015-08-17）