肺癌3p缺失区基因传感器的研究

李 琼* 伍 辉（重庆市渝北区人民医院检验科，重庆 401120）



肺癌3p缺失区基因传感器的研究

李 琼* 伍 辉
（重庆市渝北区人民医院检验科，重庆 401120）

【摘要】目的 研究3p缺失区基因传感器，早发现人类个体的基因缺失，以便预测、预防肺癌的发生，即使有早期肺癌，本人积极参与治疗，也是可以治愈的。方法 采用电化学中的循环伏安法与金电极的自组装法对缺失的靶基因进行检测。结果 自组装的金电极用循环伏安法可检测出缺失的靶基因。结论 对3p多个缺失基因的检测，可早预防、预测、治疗肺癌，具有较好的临床意义。

【关键词】3p缺失区；基因传感器；肺癌；金电极；循环伏安法

医学模式是认识健康与疾病等医学问题的思维方法，国家卫生部陈竺部长反复提出与解释的“4P”医学模式［1］即预防性（Preventive）、预测性（Predictive）、个体化（Personalized）和参与性（participatory）更加证明了疾病的预防、预测、早诊断、早治疗的重要性，同时强调干预个体生活行为以达到预防疾病、控制发展的目标。

肺癌是世界范围内的主要恶性肿瘤。其发病率和病死率在许多发达国家已上升为恶性肿瘤的第一位。跟大多数肿瘤一样，发展成肺癌需要很长时间，有的需要10年以上，而3p（人类3号染色体短臂）基因部分缺失3年以前就发生了［2-3］。如果3p缺失基因早测出，提出相应的保健干预措施，对肺癌的早期预防、预测、诊断具有非常重要的意义，同时也是“4P”医学模式的一个佐证。

电流型基因［4-5］传感器即将已知序列的单链多核苷酸脸（ssDNA）固定在电极上（该课题是金电极），当电极的单链核酸与互补靶序列杂交形成双链分子时，能表现出一定的物理信号（电流）改变，可通过电子学等技术将信号放大而显示。该电流型基因传感器检测肺癌基因缺失的方法是一种简单的、可靠的DNA杂交基因传感器。

该课题基于“4P”医学模式与电流型基因传感器的可行性，以金为基底，通过巯基与金电极形成Au-s键自组装法固定基因探针，实现对3p缺失区的基因检测，为肺癌的预防、预测、早诊断提供一个新的检测方法。

1 材料与方法

1.1 仪器：电化学工作站（辰华CHI660，上海辰华仪器有限公司），金电极（直径3 mm，天津市高仕睿联科技有限公司），移液器，Thermo，LIBROR AEL-200电子天平（日本岛津公司），BRANSON B3200S-T超声清洗仪（上海必能信超声公司）。

1.2 试剂：铁氰化钾（5 mmol/L），DNA固定与杂交缓冲液（TE Buffer组成浓度：10 mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH=8.0），3p缺失的4个基因的探针序列见表1。

表1 DNA序列表

1.3 方法

1.3.1 金电极的活化：金电极分别用1.0 μm和0.05 μm A12O3粉在鹿皮上打磨光亮后，用蒸馏水冲洗干净，分别在蒸馏水、无水乙醇、蒸馏水中超声洗涤10 min；然后将金电极浸泡在piranha（30%H2O2∶98%H2SO4=1∶3v/v）中10分钟，取出在室温下晾干待用。然后将一支活化金电极在5 mmol/L铁氰化钾缓冲溶液中循环伏安（CV）法扫描，扫速为0.1 V/s，扫描电压为0.6～-0.2 V，持续扫描直到稳定的CV图（图1中的b）。

1.3.2 基因传感器的制备：将0.5 μmol/L探针液体取5 μL滴加到活化的金电极表面，冰箱0～4 ℃中过夜，通过Au-S自组装成膜。然后金电极在5 mmol/L铁氰化钾缓冲溶液中循环伏安（CV）法扫描，扫速为0.1 V/s，扫描电压为0.6～-0.2 V，持续扫描直到稳定的CV图（图1中的a）。

图1 活化金电极与组装金电极的CV图（a：组装金电极；b：活化金电极）

1.3.3 探针浓度的选择：以系列探针浓度（以SEMA3B为例，探针浓度依次：0.1、0.5、1.0 μmol/L）液体取5 μL滴加到活化后的金电极表面，冰箱0～4 ℃中过夜，通过Au-S自组装成膜，然后组装金电极在5 mmol/L铁氰化钾缓冲溶液中循环伏安（CV）法扫描，扫速为0.1 V/s，扫描电压为0.6～-0.2 V，持续扫描直到稳定的CV图（图2），以便选择组装探针液浓度那个浓度最恰当。结合其他3个基因CV扫描峰电流情况，该课题选出固定探针浓度0.5 μmol/L。

1.3.4 靶基因浓度线性范围：滴加5 μL探针液（浓度0.5 μmol/L）在活化金电极表面，0～4 ℃过夜成膜，取出用TE缓冲液小流量冲洗自然干，滴加5 μL不同浓度的靶基因在组装金电极膜表面，37 ℃杂交2 h，取出用TE缓冲溶液冲洗自然干，然后在5 mmol/L铁氰化钾缓冲溶液中循环伏安（CV）法扫描，扫速为0.1 V/s，扫描电压为0.6～-0.2 V，持续扫描直到稳定的CV图，其响应电流随靶基因浓度的增加而不断减小（图3），且对不同浓度的靶基因作线性关系图（图4）。靶基因浓度：0、10、30、50、70、100、120、130（0.01 pmol/L）

图2 不同探针浓度的CV图（a：1.0 μmol/L b：0.5 μmol/L c：0.1μmol/L）

图3 不同靶基因浓度的CV图 图4 不同浓度的靶基因线性关系图

2 结果与讨论

2.1 活化金电极与探针膜的cv表征：图1b是活化裸金电极的cv图表征，它的氧化峰和还原峰电流峰很典型，a表示探针膜的cv图表征，它的氧化峰和还原峰电流有所下降，这是因为单核苷酸链通过Au-S自组装到到金电极上，部分阻碍了电子的传递。同时表示探针成功组装到金电极上。

2.2 基因传感器自组装不同探针浓度的cv表征（图2）：从c到a氧化峰电流与还原峰电流均降低，是因为组装的探针浓度从低到高，电子传递进一步被阻碍，因此电流降低。同时表示组装电极具有生物活性。

2.3 用自组装基因传感器分别测定靶基因浓度cv表征（图3）：氧化峰电流与还原峰电流随着靶基因浓度升高其峰电流降低，是因为杂交作用，随着浓度的增加，电子传递进一步被阻碍，因此电流降低。同时表示组装电极具有生物活性，能与对应的核苷酸单链发生杂交反应。图4的靶基因线性关系图看出，其浓度在10～100（0.01 pmol/L）成线性。图3与图4表示该基因传感器可以检测3p缺失基因。

3 结 论

利用自主装Au-S固定基因探针，成功构建了灵敏的电流型肺癌基因传感器。与传统方法相比，该方法有以下三个突出优点：①能早期筛查出肺癌发生的可能性；②自组装固定提高灵敏度；③在本实验中，以ssDNA固定作为基因模型，实验了该方法对肺癌缺失基因的检测，同时该方法可推广到其他基因的测定，在临床早诊断方面有着重要的应用，为4P医学的预防、预测、早诊断、个体化提供理论证据。

参考文献

［1］ 暴树生，师新宇.用4P医学理念构建和谐医患关系的探讨［J］.卫生软科学，2012，26（11）：954-957.

［2］ 梅新宇，孙余婕，徐美青，等.非小细胞肺癌3p染色体多区域杂合性缺失检测的研究［J］.中国肺癌杂志，2008，11（4）：534-537.

［3］ 翟艳辉，李莹，胡文利，等.染色体3p21.3缺失区域11个相关基因在非小细胞肺癌中的表达［J］.中国肺癌杂志，2009，12（8）：853-858.

［4］ 周殿明，吴一丹，刘佩，等.电化学DNA传感器［J］.化学传感器，2011，31（1）：10-17.

［5］ 谯康全，吴永强，刘新露.新型肺癌压电DNA传感器的研制［J］压电与声光，2012，34（2）：249-252.

中图分类号：R734.2

文献标识码：B

文章编号：1671-8194（2016）16-0036-02

基金项目：重庆市医学科研计划项目（编号：2012-2-297）

*通讯作者