激光共聚焦观测针药法对气虚血瘀型中风大鼠NSC分化的影响

周海纯，庄哲，郭蕊珠，王春霞，李响，董旭，吴迪，冯丽媛，蔡国锋（.黑龙江中医药大学附属第二医院，哈尔滨 5000；.哈尔滨市急救中心，哈尔滨 50056）



·动物实验·

激光共聚焦观测针药法对气虚血瘀型中风大鼠NSC分化的影响

周海纯1，庄哲1，郭蕊珠2，王春霞1，李响1，董旭1，吴迪1，冯丽媛1，蔡国锋1
（1.黑龙江中医药大学附属第二医院，哈尔滨 150001；2.哈尔滨市急救中心，哈尔滨 150056）

【摘要】目的 观察头穴丛刺法配合加味补阳还五汤灌胃对气虚血瘀型缺血性中风大鼠NSC分化的影响。方法 选取健康大鼠采用气虚血瘀证候造模，成功后予DiL染料预标记。随机分为A组、B组、C组、D组、E组和F组，F组为4只，其余各组为12只。预标记48 h后行MCAO造模，制备气虚血瘀型缺血性中风大鼠模型，模型建立成功后，A组为模型组，B组采用头穴丛刺法治疗，C组采用补阳还五汤原方灌胃治疗，D组采用加味补阳还五汤灌胃治疗，E组采用头穴丛刺法配合加味补阳还五方灌胃治疗，F组为假手术组。在各时间点分别处死取材，以神经功能评定、免疫荧光双染法、激光共聚焦观测为检测指标，进行对比研究，观察各疗法对模型大鼠NSC分化的影响。结果 B组、C组、D组和E组治疗1星期后神经功能评分与A组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。D组和E组治疗2星期后神经功能评分与A组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。E组治疗1、2星期后神经功能评分与C组和D组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）。B组、C组、D组和E组治疗1、2星期后Brdu+/NeuN+细胞计数、Brdu+/GFAP+细胞计数、Dil+/Brdu+/NeuN+细胞计数及Dil+/Brdu+/GFAP+细胞计数与A组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。D组和E组治疗1、2星期后Brdu+/NeuN+细胞计数、Brdu+/GFAP+细胞计数、Dil+/Brdu+/NeuN+细胞计数及Dil+/Brdu+/GFAP+细胞计数与B组和C组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。E组治疗1、2星期后Brdu+/NeuN+细胞计数、Brdu+/GFAP+细胞计数、Dil+/Brdu+/NeuN+细胞计数及Dil+/Brdu+/GFAP+细胞计数与D组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。结论 各种治疗方法对模型大鼠神经干细胞的分化均具有一定的促进作用，其中以头穴丛刺法配合加味补阳还五汤灌胃效果最佳。

【关键词】针刺疗法；中风；气虚血瘀；补阳还五汤；针药并用；丛刺；大鼠；头针

脑缺血疾病属中医学“中风”范畴，多起病急骤，症状多变，发展迅速，似风之善行数变，因此名之“中风”。在长期的治疗研究工作中，中医学已经积累了丰富的经验，其中头穴丛刺的治疗作用已得到广泛认可，而中药汤剂也长期应用于临床［1-2］。《医林改错》中的补阳还五汤为代表方之一［3］，其作用已得到广泛认可。临床试验已经证实补阳还五汤对神经干细胞（NSC）具有促进作用［4-5］。但笔者在长期临床实践中发现缺血性中风患者常兼有痰浊，甚或见痰蒙清窍之症，因此常在补阳还五汤的原方基础上加减变化，如临证时加石菖蒲以开窍醒神化痰，加竹茹以清热化痰，均获得较理想的疗效。然而，笔者查阅大量文献后，尚未找到相关报道进行理论支持。因此，本实验通过观察头穴丛刺法配合加味补阳还五汤灌胃对气虚血瘀型缺血性中风大鼠NSC分化的影响，为临床实践提供可靠的论证。

1 材料与方法

1.1 动物模型制备与分组

选取健康Wistar大鼠，体重为（180±20）g，实验动物由黑龙江中医药大学动物实验中心提供，合格证号为00101006。行气虚血瘀证候造模，造模方法采用持续力竭游泳法［6-9］，于气虚血瘀证候模型大鼠纳入成功后，予以DiL染料预标记处理［10］。预标记后继续行力竭游泳法维持气虚血瘀模型状态，预标记48 h后参照Zea Longa等建立的大鼠大脑中动脉内栓线阻断方法，行大脑中动脉阻塞术（MCAO）［11-12］。

模型大鼠建立成功24 h后，参照Bederson 4级评分标准进行评分。0级表现为模型大鼠未出现行为缺陷；1级表现为模型大鼠出现前肢屈曲；2级表现为模型大鼠出现侧向推力实验阳性，同时伴有前肢屈曲的现象，但是不出现转圈行为；3级表现为模型大鼠出现侧向推力实验阳性，同时伴有前肢屈曲及自发性旋转的现象。

依据评分结果进行筛选剔除，评分≥2分者筛选入组，再随机分为A组、B组、C组、D组、E组和F组，其中F组为4只，其余各组为12只。

1.2 方剂制备

由黑龙江中医药大学附属第二医院提供药材。补阳还五汤记载于清朝王清任《医林改错》，按原方比例，即黄芪：当归尾：赤芍：地龙：川芎：桃仁：红花= 40：2：1.5：1：1：1：1。清水浸泡药材后进行一煎、二煎，每次煎汁 60 min。将两次煎煮液混匀，使之浓缩（2.68 g/mL），再将浓缩液冷藏备用。

补阳还五汤加味方在原方组成比例基础上，加入 1.5比例石菖蒲和1.5比例竹茹，方剂制备依前法。

1.3 实验方法

1.3.1 治疗方法

A组实验动物予MCAO造模，术后单独普通笼中常规饲养，予等体积双蒸馏水灌胃。

B组依据“大鼠穴位图谱”，选取百会穴及百会穴左、右侧各旁开2 mm处，共3个穴位。常规消毒后，采用苏州医疗用品厂有限公司出品的0.35 mm×25 mm毫针向眼的方向行丛刺法针刺，刺入深度为沿皮平刺约3 mm，快速捻转行针5 min后，留针6 h。每日1次，共治疗2星期。

C组采用补阳还五汤灌胃治疗，给药量依据人体与动物体表面积折算，灌胃剂量约为 5 g/kg/d。灌胃频次为每日2次。

D组采用加味补阳还五汤灌胃治疗，给药方法及剂量参照C组。

E组采用头穴丛刺配合加味补阳还五汤灌胃治疗。针刺方法同B组，加味补阳还五汤灌胃的给药方法及剂量参照D组。

F组实验动物单独普通笼中常规饲养，只行动脉分离，不予MCAO，予等体积双蒸馏水灌胃。

1.3.2 BrdU标记［13］

注射前将BrdU标记物溶解在0.007 mol/L氢氧化钠的氯化钠溶液中，配置成浓度为1%的BrdU标记物溶液。脉冲标记法在大鼠处死前于大鼠腹腔注射。注射频次分为 3次注射，每 4 h注射 1次，每次剂量为50 mg/kg。在最后一次注射完成4 h后，将动物处死。

1.3.3 标本制作［14］

使用水合氯醛麻醉大鼠，水合氯醛浓度为10%。大鼠麻醉成功后，行手术开胸，使大鼠心脏暴露，右心房剪口，从左心室向大鼠体内注射，用37℃100 mL肝素化生理盐水配制冲洗液，冲洗全身血管。对实验大鼠进行血管冲洗成功后，选用 4℃浓度为 4%的多聚甲醛溶液200 mL，进行灌注固定。在灌注固定完毕后，迅速将实验大鼠断头取脑，然后建立脑组织切片标本（在前囟前1.2 mm至前囟后0.3 mm）。第1步，将组织在浓度为50%甲酰胺2Xssc65℃中放置，放置时间为2 h；第2步，将组织在2N盐酸37℃中培养，培养时间为30 min，目的是使组织DNA变性；第3步，在室温下，使用pH值为8.5、浓度为0.1 mol/L的硼酸漂洗组织10 min；第4步，脑标本经一抗后，在 4℃下保存过夜，脑组织标本经二抗后，在室温下保存2 h；第5步，使用浓度为90%甘油PBS溶液封片，备用。

1.4 统计学方法

本研究采用SPSS17.0统计软件，使用单因素组间方差分析（ANOVA）方法分析。如果P＞0.05，总体方差相等时，采用Tukey's post hoc方法配对比较进行事后检验；如果 P≤0.05，总体方差不相等时，选择Brown-Forsythe程序来从新分析。并采用不假设组间方差相等的事后检验，用Dunnett's T3方法。

2 结果

2.1 各组大鼠不同时间点神经功能评分比较

由表1可见，各组大鼠治疗前神经功能评分比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），提示治疗前各组模型大鼠在神经功能缺损程度方面不具有明显差异。在治疗后各时间点，各组大鼠神经功能缺损均有所恢复，提示模型大鼠脑损伤的程度均有所改善，因此推测神经元的数量均有所增加。其中B组、C组、D组和E组治疗1星期后神经功能评分与A组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。D组和E组治疗2星期后神经功能评分与 A组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。E组治疗1、2星期后神经功能评分与C组和 D组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）。

表1 各组大鼠不同时间点神经功能评分比较 （±s，分）

表1 各组大鼠不同时间点神经功能评分比较 （±s，分）

注：与 A组比较1）P＜0.01，2）P＜0.05；与B组比较3）P＜0.01，4）P＜0.05；与C组比较5）P＜0.01；与D组比较6）P＜0.05

组别 　n 　　治疗前 　　治疗1星期后 　　治疗2星期后A组 　12 　2.92±0.29 　2.75±0.63 　1.50±0.67 B组 　12 　2.83±0.40 　1.83±0.721）　0.75±0.62 C组 　12 　3.00±0.02 　1.83±0.721）　0.83±0.58 D组 　12 　2.83±0.39 　1.58±0.511）　0.58±0.512）E组 　12 　2.75±0.45 　0.83±0.581）3）5）6）　0.15±0.071）4）5）6）

2.2 预标记细胞检测

对预标记后的室管膜下区细胞检测，同时检测Dil标记的F组细胞，观察预标记48 h后Dil染色的细胞层，确定在SVZ无明显扩散。详见图1。

图1 预标记48 h后Dil染色的细胞层

2.3 免疫荧光分析

由于SVZ的NSC在细胞的增殖分裂时有可能丢失了标记的Dil，或者局部的干细胞增殖分化不携带Dil，因此我们同时计数了双标细胞，进而观察各组调控神经干细胞分化的作用。

2.3.1 各组不同时间点Brdu+/NeuN+细胞计数比较

由表2可见，B组、C组、D组和E组治疗1、2星期后Brdu+/NeuN+细胞计数与A组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01），提示各治疗方法对 Brdu+/NeuN+阳性细胞的表达均具有较好的促进作用。D组和E组治疗1、2星期后Brdu+/NeuN+细胞计数与B组和C组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。E组治疗1、2星期后Brdu+/NeuN+细胞计数与D组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。

表2 各组不同时间点Brdu+/NeuN+细胞计数比较（±s）

表2 各组不同时间点Brdu+/NeuN+细胞计数比较（±s）

注：与A组比较1）P＜0.01；与B组比较2）P＜0.01；与C组比较3）P＜0.01；与D组比较4）P＜0.01

组别 　n 　　治疗1星期后 　　治疗2星期后A组 　6 　11.17±1.17 　12.25±1.54 B组 　6 　17.50±0.551）　20.08±2.571）C组 　6 　18.17±1.671）　20.25±2.381）D组 　6 　20.50±1.051）2）3）　25.42±1.311）2）3）E组 　6 　24.50±1.871）2）3）4）　44.58±2.151）2）3）4）

2.3.2 各组不同时间点Brdu+/GFAP+细胞计数比较

由表3可见，B组、C组、D组和E组治疗1、2星期后 Brdu+/GFAP+细胞计数与A组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01），提示各治疗方法对 Brdu+/GFAP+阳性细胞的表达均具有较好的促进作用。D组和E组治疗1、2星期后 Brdu+/GFAP+细胞计数与B组和C组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。E组治疗1、2星期后 Brdu+/GFAP+细胞计数与D组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。

表3 各组不同时间点Brdu+/GFAP+细胞计数比较（±s）

表3 各组不同时间点Brdu+/GFAP+细胞计数比较（±s）

注：与A组比较1）P＜0.01；与B组比较2）P＜0.01；与C组比较3）P＜0.01；与D组比较4）P＜0.01

组别 　n 　　治疗1星期后 　　治疗2星期后A组 　6 　11.83±0.75 　4.33±0.52 B组 　6 　16.83±1.471）　11.33±1.211）C组 　6 　16.50±1.641）　11.50±1.051）D组 　6 　19.67±0.821）2）3）　14.33±1.211）2）3）E组 　6 　22.50±1.381）2）3）4）　18.50±1.051）2）3）4）

2.4 激光共聚焦观测

各组Dil标记的SVZ细胞均能够向缺血周边的纹状体和缺血区皮质迁移，同时在缺血损伤区周边区能够发现Dil/BrdU/NeuN或Dil/BrdU/GFAP标记的细胞的共同表达，说明了Dil标记的SVZ细胞从神经发生区向缺血损伤区迁移，分化成神经元和星形胶质细胞，证明了各种疗法均能调控SVZ细胞NSC的增殖、迁移、分化。

2.4.1 各组大鼠不同时间点Dil+/Brdu+/NeuN+细胞计数比较

Dil+/Brdu+/NeuN+细胞计数体现NSC分化为神经元的三重标记的细胞，从而体现了各法对内源性神经干细胞增殖、迁移和分化的调控作用。由表4可见，Dil+/ Brdu+/NeuN+细胞计数在各治疗组各时间点均有表达，治疗1星期后阳性细胞表达到高峰，之后开始回落。B组、C组、D组和E组治疗1、2星期后 Dil+/Brdu+/NeuN+细胞计数与 A组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。D组和E组治疗1、2星期后 Dil+/Brdu+/ NeuN+细胞计数与B组和C组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。E组治疗 1、2星期后 Dil+/Brdu+/ NeuN+细胞计数与 D组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。

表4 各组不同时间点Dil+/Brdu+/NeuN+细胞计数比较（±s）

表4 各组不同时间点Dil+/Brdu+/NeuN+细胞计数比较（±s）

注：与A组比较1）P＜0.01；与B组比较2）P＜0.01；与C组比较3）P＜0.01；与D组比较4）P＜0.01

组别 　n 　　治疗1星期后 　　治疗2星期后A组 　6 　5.50±0.55 　1.00±0.63 B组 　6 　6.83±1.031）　4.83±0.751）C组 　6 　8.17±0.751）　4.67±0.521）D组 　6 　10.33±1.211）2）3）　6.50±1.051）2）3）E组 　6 　13.00±1.671）2）3）4）　8.33±1.201）2）3）4）

2.4.2 各组大鼠不同时间点Dil+/Brdu+/GFAP+细胞计数比较

Dil+/Brdu+/GFAP+细胞计数三组增殖迁移的细胞同时表达了 GFAP，体现了星形胶质细胞的活化，从而体现各治疗方法对内源性神经干细胞增殖、迁移和分化的调控作用。由表5可见，B组、C组、D组和E组治疗1、2星期后 Dil+/Brdu+/GFAP+细胞计数与A组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。D组和E组治疗1、2星期后 Dil+/Brdu+/GFAP+细胞计数与B组和C组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。E组治疗1、2星期后 Dil+/Brdu+/GFAP+细胞计数与 D组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。

表 5 各组大鼠不同时间点 Dil+/Brdu+/GFAP+细胞计数比较 （±s）

表 5 各组大鼠不同时间点 Dil+/Brdu+/GFAP+细胞计数比较 （±s）

注：与A组比较1）P＜0.01；与B组比较2）P＜0.01；与C组比较3）P＜0.01；与D组比较4）P＜0.01

组别 　n 　　治疗1星期后 　　治疗2星期后A组 　6 　6.00±0.89 　2.67±0.82 B组 　6 　9.50±1.041）　6.50±0.551）C组 　6 　9.67±1.031）　6.33±1.031）D组 　6 　11.50±0.551）2）3）　8.33±0.521）2）3）E组 　6 　14.17±0.751）2）3）4）　11.50±0.551）2）3）4）

3 讨论

在本实验过程中遇到了诸多问题，首先在造模开始之前，我们探讨中风的发病过程，缺血性中风虽其本为虚，但急性期同时存在痰阻血瘀，痰浊和瘀血同时作为一种病理产物，也具有致病因素的含义，现代医学采用溶栓措施可迅速消除瘀血，再通复流，但同时发现随之而来的再灌注损伤可致炎症反应加剧、血管渗出增加、脑水肿加重。从中医学角度来看，这些均为非外显之痰。在临床上也观察到患者常有喉中痰鸣、呕吐甚至咳嗽咳痰的外显痰症表现。笔者认为痰浊病理因素在脑缺血损伤过程也发挥了重要作用。在造模过程中，我们对缺血性中风病证结合大鼠模型的建模思路、造模方法及模型评价体系进行了积极的探索，但根据中医学的间接研究，“证”是疾病的病因、病邪性质等的概括，动物模型实验只是一种外延法，只可能在一个局部或几个方面与人类疾病相似。在实验中，我们查阅大量文献，选用以神经功能评分评价宏观表征，以 MCAO操作完善脑缺血的形成，建立了病证结合的评价体系。然而宏观表征的观测主观性较强，而且有形之痰与无形之痰难于把握，捕捉到的该模型的表征有限，虽然我们经过大量努力，并且研究大量国内外相关文献，仍未获得理想解决方法，所以我们下一步研究工作重点在于设计更具体、严谨的表征观察方案以期待得到更完善的表征体系。

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【中图分类号】R2-03

【文献标志码】A

DOI：10.13460/j.issn.1005-0957.2016.03.0355

文章编号：1005-0957（2016）03-0355-04

收稿日期2015-11-11

基金项目：黑龙江省教育厅科学技术研究项目（12531659）

作者简介：周海纯（1980 - ），男，副主任医师

Laser Scanning Confocal Microscopical Study of the Effect of Acupuncture and Medicine on NSC Differentiation in Rats with Stroke of qi Deficiency and Blood Stasis Type

ZHOU Hai-chun1， ZHUANG Zhe1， GUO Rui-zhu2， WANG Chun-xia1， LI Xiang1， DONG Xu1， WU Di1， FENG Li-yuan1， CAI Guo-feng1.
1.Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine Second Hospital，Harbin 150001，China； 2.Harbin Emergency Center，Harbin 150056，China； 3.Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine，Harbin 150040，China

［Abstract］Objective To investigate the effect of cluster needling at scalp points plus gavage of modified Buyang Huanwu decoction on NSC differentiation in rats with ischemic stroke of qi deficiency and blood stasis type. Methods A model of qi deficiency and blood stasis syndrome was made using healthy rats. Dil dye was given for pre-labelling after the success of model making. The rats were randomized into groups A， B， C， D， E and F. Group F consisted of 4 rats and each of the other groups，of 12 rats. A rat model of ischemic stroke of qi deficiency and blood stasis type was made by MCAO at 48 hrs after pre-labelling. After the success of model making， group A was the model group， group B was treated by cluster needling at scalp points， group C was treated by an oral gavage of Buyang Huanwu decoction， group D was treated by an oral gavage of modified Buyang Huanwu decoction， group E was treated by cluster needling at scalp points plus an oral gavage of modified Buyang Huanwu decoction and group F was the sham operation group. The rats were sacrificed at various time points respectively and the materials were taken. By nerve function assessment， double immunofluorescence staining and laser scanning confocal microscopy， a comparative study was conducted to investigate the effects of different treatments on NSC differentiation. Results There was a statistically significant difference in the nerve function score between group B， C， D， E or F and group A after one week of treatment （P＜0.01），between group B or E and group A after two weeks of treatment （P＜0.05，P＜0.01） and between group E and group C or D after one and two weeks of treatment （P＜0.01，P＜0.05）. After one and two weeks of treatment， there were statistically significant differences in Brdu+/NeuN+ cell count， Brdu+/GFAP+ cell count， Dil+/Brdu+NeuN+ cell count and Dil+/Brdu+/GFAP+ cell count between group B， C， D or E and group A （P＜0.01）， between group D or E and group B or C （P＜0.01） and between groups E and D （P＜0.01）. Conclusions Various treatments have a promoting effect on nerve stem cell differentiation in the rats. Of various treatments， cluster needling at scalp points plus gavage of modified Buyang Huanwu decoction has the best therapeutic effect.

［Key words］Acupuncture therapy； Stroke； Qi deficiency and blood stasis； Buyang Huanwu decoction； Combined acupuncture and medicine； Cluster needling； Rats； Scalp acupuncturee