基于肾阳虚大鼠HPA轴的不同针刺因素正交设计研究

闵友江，邓玲，洪恩四（江西中医药大学附属医院，南昌 330006）



·动物实验·

基于肾阳虚大鼠HPA轴的不同针刺因素正交设计研究

闵友江，邓玲，洪恩四
（江西中医药大学附属医院，南昌 330006）

【摘要】目的 观察针刺对肾阳虚大鼠血清促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）、垂体促肾上腺皮质激素（ACTH）及其 mRNA表达的影响，探索影响针刺效应的主次因素和针刺参数的最佳组合。方法 基于氢化可的松肌肉注射制作的皮质酮肾阳虚实验动物模型，以血清CRH、垂体ACTH及其mRNA表达为观察指标，采用L9（34）正交表对影响针刺效应的4因素（穴位的选择、捻针角度、捻针频率、捻针时间）3水平安排试验，运用计算机控制的针刺手法仪治疗肾阳虚大鼠，通过酶联免疫检测血清中CRH、垂体中ACTH的水平和实时荧光定量PCR检测垂体组织中ACTH mRNA的表达来比较上述4因素的主次。结果 上述4因素对针刺效应的影响大小依次是捻针时间、捻针频率、捻针角度及穴位的选择，其中捻针角度、捻针频率、捻针时间是影响针刺效应的主要因素或次要因素（P＜0.01或P＞0.05）。穴位的选择是影响针刺效应的重要因素或次要因素（P＜0.05或P＞0.05）。结论 针刺治疗肾阳虚大鼠的最佳针刺参数为针刺肾俞穴，捻针角度为90°，频率为180次/min，捻针时间为120 s。不同因素对针刺治疗肾阳虚大鼠的疗效不同，其中捻针时间对疗效的影响最大，然后依次为捻针频率、捻针角度和穴位的选择。

【关键词】针刺疗法；正交设计；肾阳虚；HPA轴；大鼠

针灸是通过调和阴阳、疏通经络、扶正祛邪等作用来治疗疾病的，其中扶正祛邪又是通过针灸能产生补虚泻实的效应来实现的。一般认为针灸补虚泻实的效应与机体的机能状态、穴位的相对特异性、补泻手法、刺激量的大小等因素有关［1-4］。而刺激量的大小又与针刺强度（提插的幅度、捻转的角度、提插捻转的频率、针具的粗细、针刺深浅）和作用时间（行针时间、留针时间、针刺间隔时间、针刺次数或疗程）有关［3］。但对于针刺补泻效应与穴位的相对特异性、刺激量的关系如何？针刺刺激量能不能做到定量？影响针刺效应的主次因素是什么？能否获取最佳针刺效应多因素的最佳组合？对于这些问题，有些学者［5-7］做过一些理论上的探讨或实验研究，但存在一些不足之处。为进一步客观、科学、定量地研究针刺效应与不同针刺因素的关系，本研究在皮质酮肾阳虚大鼠模型的基础上，采用L9（34）正交表对影响针刺效应的4因素（穴位的选择、捻针角度、捻针频率、捻针时间）3水平安排试验，通过采用计算机控制针刺手法仪对实验性肾阳虚大鼠进行针刺效应影响因素定性定量化实验研究，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

60只SD雄性大鼠［湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，合格证号 SCXK（湘）2011-0003］，体重为（220±20）g，清洁级，标准配方杆状饲料喂养，自由进水。所有大鼠进行适应性饲养3 d后开始进行实验。

1.2 主要试剂与仪器

1.2.1 实验试剂

氢化可的松注射液，天津金耀氨基酸有限公司生产，5 mL/25 mg，国药准字H12020886；CRH、ACTH酶联免疫检测试剂盒，上海博谷生物科技有限公司生产；Trizol，invitrogen公司生产；DEPC处理水，基尔顿生物科技（上海）有限公司生产；氯仿、异丙醇、无水乙醇，国药集团有限公司生产；RNaseⅠ，Fermentas公司生产；SYBR Green PCR试剂盒、逆转录试剂盒，Thermo公司生产。

1.2.2 仪器与设备

0.30 mm×13 mm华佗牌一次性针灸针，苏州医疗用品厂有限公司生产；酶标仪，芬兰（Labsystems Multiskan MS）公司生产；洗板机，芬兰（Thermo Labsystems）公司生产；移液器，吉尔森 P型移液器（Pipetman） 生产；计算机控制针刺手法仪［申请（专利）号 CN200510027586.1，公开（公告）号 CN1709215］，上海中医药大学研制；旋涡振荡器，上海青浦泸西仪器厂生产；手握式电动匀浆机，德国 FLUKO 公司生产；低温冷冻离心机，Sigma（3K15）公司生产；Real-time检测仪，ABI（ABI-7300）公司生产；超纯水分离系统，美国LABCONCO公司生产。

1.3 动物分组与处理

60只SD雄性大鼠饲养3 d后，按体重查随机数字表随机分为A组（正常组）8只和B组52只。B组造模后，按体重查随机数字表随机分为模型组8只、药物组8只和治疗组36只。治疗组再分9个亚组，每组4只。

1.4 模型制备

52只大鼠按照0.03 mg/g·bw剂量肌肉注射氢化可的松注射液，每日1次，连续注射10 d。模型成功的判断标准为大鼠体重减轻，毛发失去光泽，弓背，扎堆，反应迟钝，活动减少，阴囊皱缩，尿量明显增多。

1.5 分组处理方法

1.5.1 药物组

采用右归丸配方煎药灌胃。配方参照《景岳全书》，即肉桂、制附子各6 g，山茱萸、当归各9 g，山药、枸杞子、鹿角胶、杜仲、菟丝子各12 g，熟地黄24 g。全部药材从江西中医药大学附属医院中药房购进，煎煮方法参考相关文献［8］。按 70 kg体重成年人每日 1剂、每剂400 mL煎剂计算，200 g大鼠的右归丸煎剂灌服用量换算公式［9］为，大鼠日服总量=人日服总量（400 mL）×大鼠与人体表面积比（0.018）=7.2 mL。分两次灌服，共治疗14 d。

1.5.2 治疗组

采用针刺治疗，穴位定位根据《实验针灸学》［10］，针刺前剪去相应穴位处的毛发。采用自制的固定器捆绑大鼠，将0.30 mm×13 mm毫针刺入穴位5～7 mm，进针后行小幅度提插捻转，然后与针刺手法仪连接，按相应参数进行针刺手法操作，留针10 min后再行手法操作1次，再留针10 min后出针。每日1次，共治疗14 d。

1.5.2.1 实验干预因素设计

因素 A（针刺穴位的选择）：根据前期工作基础，选择肾俞穴治疗肾阳虚证大鼠；选择前三里作为对照穴位之一；非穴区，拟选择前三里旁开5 mm处的点，作为对照穴位之一。

因素 B（捻针角度）：综合文献和项目组成人员的临床经验，拟将捻针角度设定为360°、180°和90°3个水平。

因素 C（捻针频率）：综合文献和项目组成人员的临床经验，拟将捻针频率设定为 180次/min、120次/min和60次/min 3个水平。

因素 D（捻针时间）：综合文献和和前期研究，拟将每次捻针的时间设定为120 s、60 s和30 s 3个水平。

影响针刺效应的因素有针刺穴位的选择、捻针角度、捻针频率、捻针时间，本实验在肾阳虚大鼠模型的基础对上述4因素3水平采用正交表安排试验。查统计表，选择L9（34）正交设计表安排实验。详见表1。

表1 L9（34）正交设计实验因素及水平数

1.5.2.2 L9（34）正交设计方案

治疗组各亚组具体分组及干预措施见表2。

1.5.3 模型组和正常组

模型组和正常组大鼠在治疗组治疗期间进行相同的捆绑。

1.6 指标检测及方法

1.6.1 标本采集

治疗结束第2天处死全部大鼠。抽取动脉血，离心，取上清液，分装，-20℃的冰箱中保存备用。断头，用咬骨钳咬掉颅骨，分离垂体组织，立即投入到液氮中速冻，然后放入-80℃的冰箱中保存备用。

表2 L9（34）正交设计具体分组及干预措施

1.6.2 血清促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）、垂体促肾上腺皮质激素（ACTH）的检测

采用酶联免疫方法测量其浓度，按照试剂盒说明书进行操作。

1.6.3 垂体ACTH mRNA表达的检测

采用实时荧光定量 PCR。组织总 RNA的抽提按Trizol说明书操作。

cDNA第一条链的合成步骤分为，①总RNA中DNA的消除，DNaseⅠ：1 μL；10×DNaseⅠ Buffer：1 μL；总RNA≤1 ng；DEPC-H2O：n μL；总体积为10 μL。反应条件为37℃，30 min；Hold，加 1 μL的EDTA；65℃，10 min。②反转录，按以下体系加入，RNA-Primer Mix：12 μL；5×RT Reaction Buffer：5 μL；25mM dNTPs：1 μL；25 U/μL RNase Inhibitor：1 μL；200 U/μL M-MLV Rtase：1 μL；Oligo（dt）18：1 μL；ddH2O（DNase- free）：4 μL；总体积为25 μL。反应程序为37℃， 60 min；85℃，5 min；4℃，5 min；置于-20℃保存。③Real-time PCR扩增，将制备好的 cDNA进行 PCR扩增。扩增体系如下，SYBRGreen Mix：12.5 μL；上游引物 F：0.5 μL；下游引物R：0.5 μL；ddH2O：9.5 μL；cDNA模板：2 μL。总体积为25 μL。反应程序为95℃，10 min （95℃，15 s；60℃，45 s）×40；95℃，15 s；60℃，1 min； 95℃，15 s；60℃，15 s。引物的合成与纯化均由上海捷瑞生物科技有限公司提供。ACTH上游引物序列为5'-GCAAAGAACGAAGTCCGTGA-3'，下游引物序列为 5'-GATGGTGCTTGCTGTTGACC-3'。④相对mRNA表达水平的计算数据分析采用 ABI Prism 7300 SDS Software。每个样品中靶基因的相对 mRNA表达水平采用以下公式计算，即相对mRNA表达=2-△Ct×100%，其中△Ct=靶基因Ct值－管家基因Ct值。

1.7 统计学方法

采用SPSS16.0软件进行统计分析，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。实验数据以均数±标准差表示。正常组、模型组和药物组比较采用F检验及SNK检验；L9（34）正交设计各治疗亚组组间比较采用极差分析和正交设计方差分析，以确定因素各水平的优劣、分析因素的主次，找出最佳试验方案。

2 实验结果

2.1 一般情况观察

大鼠造模后体重减轻，毛发失去光泽，弓背，扎堆，反应迟钝，活动减少，阴囊皱缩，尿量明显增多。经针刺和右归丸治疗后，治疗组和药物组大鼠食欲增加，体重加重，毛发渐渐有光泽，喜欢活动，而模型组的大鼠整体情况不佳。

2.2 各组大鼠血清CRH、垂体ACTH水平及其mRNA表达比较

2.2.1 模型组、正常组和药物组组间比较

由表3可见，模型组大鼠血清CRH、垂体ACTH水平及其mRNA表达与正常组比较，差异均有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）。药物组大鼠血清CRH和垂体ACTH水平与正常组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。模型组大鼠血清 CRH水平与药物组比较，差异具有统计学意义（P＜0.01）。通过大鼠一般情况的比较及以方测证的结果，提示采用氢化可的松造模方法是成功的。

表 3 模型组、正常组和药物组大鼠血清 CRH、垂体 ACTH水平及其mRNA表达比较 （±s）

表 3 模型组、正常组和药物组大鼠血清 CRH、垂体 ACTH水平及其mRNA表达比较 （±s）

注：由于ACTH mRNA检测的数值较小，表中ACTH mRNA 所有数值是×100后的结果；与模型组比较1）P＜0.01，2）P＜0.05；与药物组比较3）P＜0.05

组别 　n　CRH（pg/mL） 　ACTH（pg/mL） 　ACTH mRNA模型组 　8 　70.01±2.84 　10.58±0.95 　196.66±9.451）2）正常组 　8 　121.54±11.891）3）12.70±1.782）3）　181.17±7.351）药物组 8 　106.13±4.441）　11.24±0.91 　219.42±8.94

2.2.2 L9（34）正交设计各治疗组亚组组间比较

表4 L9（34）正交实验设计方案及相关指标极差分析

L9（34）正交设计各治疗组亚组组间比较采用极差分析，即直观分析，R值越大，表示针刺治疗效果越好。由表4、5可见，对血清CRH水平的影响从大到小排列顺序为穴位选择、捻针时间、捻针角度、捻针频率，且最佳组合是A2B3C2D3，即针刺前三里，捻针30 d，捻针角度为180°，频率为60次/min；对垂体ACTH的影响从大到小排列顺序为穴位的选择、捻针时间、捻针频率、捻针角度，且最佳组合是 A3B1C3D2，即针刺肾俞穴，捻针角度为360°，频率为 60次/min，捻针60 s；对垂体ACTH mRNA表达的影响从大到小排列顺序为捻针时间、捻针频率、捻针角度、穴位的选择，且最佳组合是A3B3C1D1或 A2B3C1D1，即针刺肾俞穴或前三里，捻针角度为180°，频率为180次/min，捻针120 s。

结合表6方差分析的结果，对血清CRH的影响，各因素都是次要因素，故在极差分析综合评定排除在外。综合各因素对垂体中ACTH及其mRNA表达的影响的分析，最佳组合是 A3B3C1D1，即针刺肾俞穴，捻针角度为90°，频率为180次/min，捻针时间120 s。对针刺效应的影响从大到小排列顺序为捻针时间、捻针频率、捻针角度、穴位的选择。

综合以血清CRH、垂体ACTH的水平及其mRNA的表达为观察对象进行的上述4因素3水平间比较的方差分析结果显示，针刺捻针的角度、捻针频率、捻针时间是影响针刺效应的主要因素或次要因素，P＜0.01 或 P＞0.05；穴位的选择是影响针刺效应的重要因素或次要因素，P＜0.05或P＞0.05。从表中F值可看出，F值越大，其因素对针刺效应的影响越大。详见表6。

表5 血清CRH、垂体ACTH水平及其mRNA表达与各项因素极差分析

表6 以血清CRH、垂体ACTH水平及其mRNA表达为观察指标的针刺多因素方差分析

3 讨论

临床长期大量使用肾上腺皮质激素治疗的患者停药后表现为肾上腺皮质功能低下出现肾阳虚一系列症状。沈自尹院士［11］几十年来的研究证实肾阳虚证的物质基础在于下丘脑-垂体-靶腺（肾上腺、甲状腺、性腺）轴的功能低下。糖皮质激素（人类主要为皮质醇，大鼠主要为皮质酮）是下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA轴）的终末激素，它可以调节人体的代谢，认知功能，情绪等。下丘脑分泌CRH作用于腺垂体，调控腺垂体ACTH的分泌，ACTH 又可作用于肾上腺皮质，影响 HPA轴终末激素的分泌，由此构成了由上到下的顺行调控。同时各激素又可反馈作用于其上级中枢，调节上级激素的释放，从而形成复杂的调节环路。蒋淑君等［12］研究发现大剂量的山茱萸提取物能使肾阳虚大鼠含量低下的下丘脑CRH 升高。陈津岩等［13］采用氢化可的松复制肾阳虚证动物模型，发现模型组大鼠下丘脑CRH、血浆ACTH和CORT含量显著下降，经服右归丸后ACTH和CORT含量显著上升，下丘脑 CRH含量也有所上升。任大蔚等［14］采用氢化可的松肌肉注射制作皮质酮肾阳虚实验动物模型，模型组大鼠血清CORT、ACTH含量明显低于正常对照组，经艾灸肾俞、关元后两者含量都较模型组升高。本实验中模型组大鼠血清CRH、垂体中ACTH的水平及其mRNA的表达分别明显低于正常对照组，右归丸治疗后上述指标都有不同程度的升高。另外不同针刺治疗组上述指标的均值大部分高于模型组，针刺治疗肾阳虚证的作用机制可能是针刺能够使功能低下的HPA轴功能趋于正常。

肾阳虚证模型是中医虚证实验研究中运用得最多且比较成功的动物模型之一。该动物模型是依据临床肾阳虚患者肾上腺皮质功能低下而设计的。基于前期研究［9］及按照陈英华等［15］提出的评价肾阳虚动物模型从一般状态与实验检测、客观指标、药物反证几个方面进行评价的科学设想，本实验采用氢化可的松肌肉注射制作肾阳虚证实验动物模型；通过对大鼠进行一般情况观察、右归丸治疗反证、模型组血清 CRH、垂体ACTH水平及其mRNA的表达分别明显低于正常对照组和右归丸治疗组，表明模型成功。

本实验分别以血清CRH、垂体ACTH水平及其mRNA的表达为观察对象进行方差分析，针刺捻针的角度、捻针频率、捻针时间是影响针刺效应的主要因素，而三者是构成针刺刺激量的主要要素。且在本实验中捻针时间对针刺效应影响最大，其次是捻针频率，再次是捻针角度。可能是由于体重200 g大鼠的表面积是70 kg人的1/56［10］，直径0.30 mm的针灸针作用于大鼠，则相当于一枚直径为 2.39 mm（0.32×的钢针作用于人体［9］。黄宇琨等［16］在分析针刺作用力时认为按应力性质，针刺力作用可分为 3种作用，即压应力作用（如插入），张应力作用（如抽提）和剪应力作用（如搓柄）。捻转属于旋扭交变应力作用，其特点除应力方向可相反外，最重要的是剪应力作用强烈，并认为针刺力以剪应力作用最为重要。捻针频率、捻针角度是影响剪应力作用的主要因素，针刺捻针时间则是影响剪应力作用量积累的主要因素之一，再加上相当于钢钉的针作用于大鼠机体，刺激量有多大可以想象。故三者在本实验中是影响针刺效应的主要因素。

腧穴的选择是影响针刺效应的重要因素，笔者曾从古代文献简述、脏腑经穴相关、神经生理学、实验研究等方面进行过分析［9］。对于肾阳虚证来说，选择肾俞穴的治疗效果要好于前三里，好于非穴区。肾俞穴为肾的背俞穴，是治肾的重要腧穴。《医宗金鉴》：“肾俞，主治下元诸虚，精冷无子。”现代医学研究表明，肾俞穴区的组织受第1～3腰神经节段支配，第1～3腰神经前支参与腰丛的组成，从腰丛发出髂腹股沟神经和生殖股神经支配生殖器；肾俞穴所在的腰部有 4对腰神经节，位于腰椎体前外侧与腰大肌内侧缘之间，腰神经节连成腰交感干；腰交感干通过交通支与 5对腰神经相连，并随腰神经分布；腰交感干还有一腰内脏神经，通过这一神经与腹盆部的脏器如肾、肾上腺、内生殖器官等联系；这可能就是经穴-脏腑相关学说和背俞穴治疗相应脏腑疾病的物质基础之一。杨廉等［17］研究发现温针灸肾俞穴具有明显调节性激素的作用，可以使老年雌性大鼠明显低下的雌二醇与孕酮水平升高。而前三里是手阳明大肠经的腧穴，与肾没有直接的关系；从现代医学分析，前三里与肾阳虚证的靶腺（肾上腺、甲状腺、性腺）也没有直接的联系。而非穴区更无上述相关联系。因此，通过上述的分析与本实验研究的结果，腧穴主治作用还是有相对特异性的。

本实验使用的计算机控制针刺手法仪只能够对针刺捻转的角度、频率、时间进行定量控制，笔者曾对该仪器的改进进行过设想［18］，由于硬件和软件等各方面的原因，本次实验采用的计算机控制针刺手法仪还是不能模拟针刺补泻手法，我们知道针刺补泻手法很可能与针刺取穴、捻针角度、频率、时间存在交互作用，由于仪器的原因，补泻手法没有作为独立因素进行研究，这是本实验的不足之处，但也是课题组今后努力的方向。

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【中图分类号】R2-03

【文献标志码】A

DOI：10.13460/j.issn.1005-0957.2016.03.0339

文章编号：1005-0957（2016）03-0339-05

收稿日期2015-11-02

基金项目：江西省教育厅科技项目（GJJ10559）；国家自然科学基金项目（81360562）

作者简介：闵友江（1975 - ），男，副主任医师

通信作者：洪恩四（1965 - ），男，主任医师，Email：myj2002@126.com

Orthogonal Study on Different Acupuncture Factors Based on Hypothalamic-pituitary-adrenal Axis in Rats with Kidney Yang Deficiency

MIN You-jiang， DENG Ling， HONG En-si.
Affiliated Hospital of Jiangxi University of Chinese Medicine，Nanchang 330006，China

［Abstract］Objective To observe the effect of acupuncture on the expressions of serum corticotropin-releasing hormone （CRH），pituitary adrenocorticotropic hormone （ACTH） and its mRNA， to discuss the predominant and secondary factors that influence the efficacy of acupuncture， and to explore the optimal combination of acupuncture parameters. Method The rat model of kidney yang deficiency was made by muscular injection with hydrocortisone. Serum CRH， pituitary ACTH and its mRNA expressions were taken as the observation indexes， and 4 influential factors （i.e. selection of acupoints， angle of needle twisting， frequency of needle twisting，and time of needle twisting） plus 3 levels of each factor were arranged to L9（34） orthogonal table. A computer-controlled acupuncture manipulation device was used to treat the kidney yang rats. Serum CRH and pituitary ACTH were detected by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） and pituitary ACTH mRNA expression by real time fluorescent quantitative PCR， to illustrate the primary and secondary factors that affect the acupuncture effectiveness. Results Regarding the effect on acupuncture effectiveness，the time of needle twisting ranked the top， followed by frequency of needle twisting， angle of needle twisting， and selection of acupoints. Angle of needle twisting， frequency of needle twisting， and time of needle twisting should be the predominant factors or secondary factors in influencing acupuncture effectiveness （P＜0.01 or P＞0.05）. Selection of acupoints should be an important factor or secondary factor in influencing acupuncture effectiveness （P＜0.05 or P＞0.05）. Conclusion For rats with kidney yang deficiency， the optimal acupuncture parameters combination should be acupuncture at Shenshu （BL 23）， with twisting angle by 90°，twisting frequency at 180/min， and needle twisting time 120 s. Different factors can produce different effects on the therapeutic efficacy of acupuncture in treating rats with kidney yang deficiency； among the factors， the time of needle twisting produces the most significant effect， followed by frequency of needle twisting， angle of needle twisting， and selection of acupoints.

［Key words］Acupuncture therapy； Orthogonal design； Kidney yang deficiency； Hypothalamic-pituitary-adrenal axis； Rats