针刺对卒中后抑郁大鼠空间学习记忆功能及海马CA3区脑源性神经营养因子的影响

蔡丽,刘毅,陆小青(上海中医药大学附属市中医医院,上海 200071)



·动物实验·

针刺对卒中后抑郁大鼠空间学习记忆功能及海马CA3区脑源性神经营养因子的影响

蔡丽,刘毅,陆小青
(上海中医药大学附属市中医医院,上海 200071)

【摘要】目的观察针刺百会、印堂、四神聪穴对卒中后抑郁(PSD)模型大鼠空间学习记忆功能及海马区脑源性神经营养因子(BDNF)表达水平的影响。方法将30只成年雄性SD大鼠,按随机数字表随机分为对照组、针刺组及假手术组,每组10只。采用经典的线栓大脑中动脉阻塞(MCAO)法加用慢性不可预见温和应激(CUMS)结合孤养建立大鼠PSD模型。于应激开始第14天开始,针刺组予以针刺干预,连续干预14 d。应激结束后1星期进行Morris水迷宫试验,评价大鼠空间学习与记忆功能。水迷宫测试结束后用免疫组化法测定海马CA3区BDNF的表达。结果与假手术组比较,对照组大鼠学习能力显著下降(P＜0.05),反映记忆功能的空间探索时间和跨平台次数均显著降低,分别是(22.36±6.20)s与(48.73±5.40)s、(3.72±0.90)次与(8.60±1.10)次,差异具有统计学意义(P＜0.01)。PSD大鼠经针刺治疗后,与对照组比较,学习能力及空间探索时间和跨平台次数、BDNF表达均显著提高,差异具有统计学意义(P＜0.01)。结论针刺治疗可改善卒中后抑郁大鼠的空间学习记忆功能,提高卒中后抑郁大鼠模型海马区BDNF水平。

【关键词】针刺;中风并发症;抑郁症;脑源性神经营养因子;记忆障碍;大鼠

卒中后抑郁(post-stroke depression,PSD)是脑卒中后最常见的神经精神并发症,可严重影响脑卒中患者神经功能、认知功能及日常生活能力,成为影响患者功能恢复和卒中复发的独立危险因素[1-2]。近年来,脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)在应激所致学习记忆损伤机制中的作用愈来愈引起人们的重视。BDNF主要在中枢神经系统内表达,不仅对神经元的生存、生长、分化有重要的影响,而且还能增强突触联系,影响神经元的可塑性,与学习记忆有关[3]。前期研究发现,针刺治疗可以改善卒中后抑郁患者的抑郁状况,提高卒中后抑郁大鼠模型皮质区单胺类神经递质水平[4-5]。本研究旨在通过建立PSD动物模型,予以针刺干预,进一步探讨针刺治疗对PSD模型大鼠空间学习记忆功能及海马CA3区BDNF表达变化的关系,为研究针刺治疗PSD学习记忆障碍的分子机制提供依据。

1　材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物

清洁级健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠36 只,3月龄,体重(220±20)g,上海实验动物研究中心提供。所有大鼠分笼喂养于循环房内,温度(23±2)℃,湿度60%,光/暗周期为12/l2 h,适应饲养1星期,自由摄食、饮水。每日逐只抚摸捉拿大鼠,使其适应实验人员的操作。其间进行蔗糖水消耗训练,1星期后进行旷场试验行为评分,测定蔗糖水消耗和旷场试验基线值。

1.1.2仪器与试剂

Morris水迷宫(上海欣软信息科技有限公司XR-XM101),恒温浴槽(XR-XM101-D2)、日本OLYMPUS摄影显微镜(CH型)、moticam 3000显微摄影成像系统、电热吹风机、兔抗BDNF多克隆抗体、BDNF免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司),10%水合氯醛、4%多聚甲醛溶液等。

1.2实验方法

1.2.1造模方法

采用经典的线栓法大脑中动脉阻塞手术(MCAO)建立脑缺血模型,加用慢性不可预见温和应激(CUMS)结合孤养,建立大鼠PSD模型。MCAO模型参照改良的Koizumi方法建立[6]。术后24 h按Longa EZ等[7]标准行神经功能评分。CUMS在MCAO术后7 d开始(神经功能缺损已基本恢复),按Willner P[8]和Katz RJ方法[9]略改进,将①禁食、禁水20 h;②禁水17 h;③倾斜鼠笼(45℃)17 h;④持续光照17 h;⑤湿笼(100 g锯屑加200 mL水)21 h;⑥4℃水中游泳5 min;⑦水平摇晃5 min;⑧行为限制2 h;⑨夹尾1 min;共9种刺激每天随机采取1种,共安排21 d。孤养,即单笼饲养[10]。用蔗糖水消耗试验评价抑郁模型的可靠程度[11]。

1.2.2动物分组与处理

选取测定蔗糖水消耗量相近的大鼠30只,按照SPSS13.0生成随机数字表,随机分为对照组、针刺组和假手术组,每组10只。对照组和针刺组大鼠予以线栓法大脑中动脉阻塞加用慢性不可预见温和应激结合孤养处理,假手术组大鼠接受相同手术流程,但不插入线栓,不进行应激和孤养处理,旨在排除手术对大鼠抑郁状态的影响。

1.2.3干预方法

应激开始第14天开始对针刺组大鼠予以针刺干预,参照大鼠脑立体定位图谱[12],采用前囟定位,采用《实验针灸学》[13]中有关大鼠穴位定位方法,针刺大鼠百会、印堂、四神聪穴。使用0.30 mm×13 mm毫针(华佗牌,苏州医疗用品厂有限公司)针刺治疗。百会、印堂、四神聪均为斜刺,深度均为0.2～0.3 mm,每次留针30 min,每隔10 min行针1次,每天1次,连续干预14 d。

1.2.4Morris水迷宫测试

测试在应激干预结束后1星期参照相关文献[14]进行,包括定位航行实验及空间探索实验两部分,其中定位航行实验用于测试学习功能,空间探索实验用于测试记忆功能。

定位航行实验通过观测大鼠的逃避潜伏期来检测其学习记忆能力,即从入水到找到并爬上平台所需时间。前5 d进行定位航行训练,将大鼠分别从不同象限头面向池壁投入水中,计算机自动跟踪并分析大鼠寻找平台的潜伏期,如果120 s仍未找到平台,则人为引到平台并停留30 s,此时逃避潜伏期记录为120 s。每只动物每天训练4次(分别从不同的象限入水),每次训练之间间隔10 min,连续训练5 d,将每天记录的4次逃避潜伏期取平均值,作为大鼠当天的学习指标。5 d训练结束后撤除平台,在水池第三象限周边壁上做明显标记(黑色三角),开始空间探索实验。将大鼠放入任一象限,分析60 s内大鼠在平台所在象限的停留时间(空间探索时间)和跨平台次数,作为记忆能力的评价指标。

每次训练之间和4次训练完成后,迅速将大鼠洗净擦干,用吹风机吹干,以防大鼠低体温。训练结束后清洗游泳路线及侧壁以消除嗅觉对测试的影响。

1.2.5海马组织处理及海马CA3区BDNF检测

水迷宫实验结束后,大鼠用10%水合氯醛腹腔内注射麻醉,置于木板平台上,打开胸腔,生理盐水心脏灌流。取脑组织放入4%多聚甲醛溶液中固定6 h,再置入30%蔗糖溶液中,待组织下沉时取海马组织石蜡包埋。常温下连续经海马矢状切片,片厚5mm,每6张切片选一张用以研究,用链霉素抗生物素蛋白生物素复合物法(strept-avidin-biotin complex,SABC)行BDNF组织化学染色,免疫组化染色法按试剂盒说明书操作步骤进行。每张切片400倍镜下摄片,每组取不连续10个视野的均值,显微镜观察阳性细胞计数并摄片,借助图像分析软件Simple PCI(V5.2,compix Inc德国)进行定量分析。阳性表达在神经元细胞胞质中,胶质细胞有部分表达,呈黄色或棕色。

1.3统计学方法

用SPSS20.0统计软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示,两个样本均数比较采用t检验,多个样本均数比较采用单因素方差分析,差别以P＜0.05为有统计学意义,P＜0.01为有显著统计学意义。

2　结果

本实验中由于意外等原因,对照组与针刺组各死亡1只大鼠。

2.1各组大鼠不同时期糖水消耗量比较

在应激第14天后,对照组、针刺组糖水消耗量较假手术组明显下降,差异具有统计学意义(P＜0.01)。在针刺干预第7天后,针刺组糖水消耗量较对照组有明显增高,差异有显著统计学意义(P＜0.01)。表明试验建立的卒中后抑郁模型是有效的,经过针刺治疗干预,糖水消耗量的提高证明了针刺治疗的有效性。详见表1。

表1　各组大鼠不同时期糖水消耗量比较(±s,%)

表1　各组大鼠不同时期糖水消耗量比较(±s,%)

注:与假手术组比较1)P＜0.01;与对照组比较2)P＜0.01

组别　n　应激前　应激第6天　应激第14天(干预第1天)应激第21天(应激结束,干预第7天) 第28天(干预第14天)假手术组　10　85.74±12.31　82.16±11.85　86.17±10.12　84.54±12.28　87.32±13.35对照组　9　86.03±12.51　80.81±16.21　63.25±12.451)　52.36±13.14　44.77±15.78针刺组　9　86.68±13.25　79.67±14.38　64.38±13.121)　67.14±13.15　75.63±11.272)

2.2各组大鼠定位航行学习能力比较(逃避潜伏期比较)

自训练第2天开始,对照组逃避潜伏期的时间明显长于同时点的假手术组,差异有显著统计学意义(P＜0.01)。而针刺组与对照组比较,逃避潜伏期的时间明显短于同时点的对照组,差异有显著统计学意义(P ＜0.01)。结果表明卒中后抑郁影响大鼠的学习能力,而针刺干预可有效改善这一影响。详见表2。

表2　各组大鼠逃避潜伏期比较(±s,s)

表2　各组大鼠逃避潜伏期比较(±s,s)

注:与假手术组比较1)P＜0.01;与对照组比较2)P＜0.01

组别　n　第1天　第2天　第3天　第4天　第5天假手术组　10　103.23±8.30　91.16±7.80　65.18±6.40　42.53±7.20　21.30±6.70对照组　9　112.04±9.10　104.76±6.90　83.26±7.401)　72.38±8.20　52.77±7.601)针刺组　9　108.69±7.70　97.66±6.40　69.35±6.401)　51.13±8.10　30.33±7.202)

2.3各组大鼠空间搜索能力比较

3组大鼠间空间探索时间和跨平台次数比较差异均具有统计学意义(P＜0.05),对照组记忆功能受损最明显。经针刺干预治疗后,针刺组大鼠的记忆功能显著提高,与对照组比较差异有显著统计学意义(P＜0.01)。表明卒中后抑郁大鼠的记忆能力下降,而针刺干预治疗可有效改善PSD大鼠的记忆能力。详见表3。

表3　各组大鼠空间探索时间和跨平台次数比较　(±s)

表3　各组大鼠空间探索时间和跨平台次数比较　(±s)

注:与假手术组比较1)P＜0.01;与对照组比较2)P＜0.01

组别　n　空间探索时间(s)　跨平台次数(n)假手术组　10　48.73±5.40　8.60±1.10对照组　9　22.36±6.20　3.72±0.901)针刺组　9　36.59±5.70　6.96±1.302)

2.4各组大鼠海马CA3区BDNF表达水平比较

3组大鼠海马CA3区BDNF阳性细胞数比较差异有显著统计学意义(P＜0.01),对照组阳性细胞数最少,针刺组较对照组有所提高。详见表4。

表4　各组大鼠海马CA3区BDNF阳性细胞数比较(±s,个)

注:与假手术组比较1)P＜0.01;与对照组比较2)P＜0.01

组别　n　阳性细胞数假手术组　10　68.20±6.50对照组　9　40.50±5.801)针刺组　9　59.60±7.102)

2.5各组大鼠BDNF免疫组织化学染色结果

海马区BDNF免疫组化阳性反映在神经元细胞胞质中,胶质细胞有部分表达,呈黄色或棕色。从结果看,对照组BDNF水平明显低于假手术组(P＜0.01),而针刺组明显高于对照组(P＜0.01),说明针刺治疗可促进BDNF的表达水平。详见图1。

图1　各组大鼠海马区BDNF免疫组化染色结果(✕400)

3　讨论

卒中后抑郁是指卒中后出现的以情绪低落、兴趣减退、消极悲观、易激惹、淡漠、失眠、焦虑,甚至出现自杀倾向为主要表现的病症,是卒中常见并发症之一,严重影响患者的认知功能和学习记忆水平[15-17]。中医学认为其病位在脑窍,肝肾亏虚、气郁痰阻为其基本病机[18-20],所以PSD的治疗当醒脑开窍解郁为主[21-24]。百会穴位居颠顶部,其深处即为脑之所在,为督脉经穴,督脉又归属与脑。根据《灵枢·卫气》理论,“头气有街”“气在头者,止之于脑”“脑为髓海”,百会为调节大脑功能的要穴[25-27]。印堂、四神聪均为经外奇穴,有宁心安神、醒脑开窍的作用[28-31]。前期研究显示[5],针刺百会、印堂、四神聪穴可以改善PSD患者的抑郁状况,提高PSD大鼠模型皮质区单胺类神经递质水平,为针刺治疗PSD可能与调节皮质区单胺类递质平衡提供了实验室依据。BDNF是神经营养家族的重要一员,广泛分布于成年哺乳动物和人体的中枢及外周神经系统,主要由海马和大脑皮质合成,对神经元的存活、分化及损伤后修复方面发挥重要作用,可促进海马神经再生,逆转突触丢失,改善细胞信号转导,恢复学习与记忆功能。从本实验结果分析,对照组和针刺组较假手术组,逃避潜伏期时间增长、停留时间(空间探索时间)和跨平台次数减小,表明卒中后抑郁影响大鼠的学习记忆能力。针刺组糖水消耗量较对照组明显增高,逃避潜伏期的时间明显缩短,空间探索时间和跨平台次数增多,表明针刺干预可有效改善抑郁对学习记忆能力的影响。从海马CA3区BDNF检测结果分析,对照组BDNF阳性细胞数和表达水平明显低于假手术组,而针刺组明显高于对照组,说明针刺治疗可促进BDNF的表达水平,改善抑郁症状。

因此,我们认为脑卒中抑郁可导致空间学习记忆能力下降,针刺治疗可以改善PSD大鼠学习空间记忆功能,这可能与针刺可以提高大脑海马区BDNF水平有关,但有关机制有待进一步深入研究。

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【中图分类号】R2-03

【文献标志码】A

DOI:10.13460/j.issn.1005-0957.2016.04.0462

文章编号:1005-0957(2016)04-0462-04

收稿日期2015-07-20

基金项目:上海市教委预算内项目(2012JW60);上海市青年医师培养项目;上海市中医医院优青项目

作者简介:蔡丽(1984-),女,主治医师,硕士,Email:cailiys@163.com

Effect of Acupuncture on Spatial Learning and Memory Abilities and Hippocampal CA3 Regional BDNF in Rats with

Post-stroke Depression

CAI Li,LIU Yi,LU Xiao-qing.
Shanghai University of Traditional Chinese Medicine Municipal Hospital

of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 200071,China

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effects of acupuncture at points Baihui(GV20),Yintang(Ex-HN3)and Sishencong (Ex-HN1)on spatial learning and memory abilities and hippocampal expression of brain-derived neurotrophic factor(BDNF)in a rat model of post-stroke depression(PSD).MethodThirty male adult SD rats were allocated,using a random number table,tocontrol, acupuncture and sham operation groups,10 rats each.A rat model of PSD was made by classical middle cerebral artery occlusion (MCAO)using an intraluminal thread technique,chronic unpredictable mild stress(CUMS)and solitary feeding.At the fourteenth day after the beginning of stress,the acupuncture group received acupuncture intervention for 14 consecutive days.At one week after the end of stress,the Morris water maze test was conducted to assess rat spatial learning and memory abilities.After the completion of the water maze test,hippocampal CA3 regional BDNF expression was determined by immunohistochemical method. ResultRat learning and memory abilities decreased significantly in the control group compared with the sham operation group(P ＜0.05).Space exploration time and the number of crossing platform reflecting memory abilities decreased significantly in the control group(22.36±6.20 s and 3.72±0.90 times,respectively)compared with the sham operation group(48.73±5.40 s and 8.60±1.10 times,respectively);there were statistically significant differences(P＜0.01).Learning abilities,space exploration time, the number of crossing platform and BDNF expression increased significantly in PSD rats treated with acupuncture compared with the control group;there were statistically significant differences(P＜0.01).ConclusionAcupuncture can improve spatial learning and memory abilities and raise hippocampal regional BDNF levels in rats with post-stroke depression.

[Key words]Acupuncture;Stroke complications;Depression;Brain-derived neurotrophic factor;Dysmnesia;Rats?