木瓜内生真菌乙酸乙酯萃取部位胃粘膜保护作用实验研究

鄢荣榜　卢巧巧　贺海波　王心怡　张永峰　覃慧林　汪鋆植

(1. 三峡大学 生物与制药学院, 湖北 宜昌　443002; 2. 湖北航天杜勒制药有限公司, 湖北 宜昌　443100; 3. 三峡大学 医学院, 湖北 宜昌　443002)



木瓜内生真菌乙酸乙酯萃取部位胃粘膜保护作用实验研究

鄢荣榜1，2卢巧巧3贺海波1王心怡3张永峰1覃慧林1汪鋆植1

(1. 三峡大学 生物与制药学院, 湖北 宜昌443002; 2. 湖北航天杜勒制药有限公司, 湖北 宜昌443100; 3. 三峡大学 医学院, 湖北 宜昌443002)

摘要：研究了木瓜内生真菌乙酸乙酯萃取部位胃粘膜保护作用及可能的机制．将昆明小鼠完全随机分为空白组、模型组、木瓜内生真菌乙酸乙酯萃取部位(50、100 mg/kg)及奥美拉唑(20 mg/kg)组，给药组小鼠分别灌胃给予相应药物，每天1次，连续5 d，末次给药1 h后，除空白组外，各组小鼠分别安10 ml/kg灌胃给予阿司匹林的乙醇溶液(15 mg阿司匹林溶解于10 ml 80%乙醇中)，4 h后取胃，延胃大弯剖开，除去胃内容物，观察胃粘膜外观形态，并计算胃溃疡发生率、胃溃疡指数及胃溃疡抑制率；刮取胃粘膜，匀浆后，取上清，用试剂盒检测胃粘膜中H+/K+-ATPase、COX-2和PGE2活性；取胃粘膜组织，经HE染色后进行组织形态学观察．木瓜内生真菌乙酸乙酯萃取部位能明显降低胃粘膜中H+/K+-ATPase、COX-2活性，升高PGE2活性，改善胃粘膜组织形态，促进溃疡愈合(P<0.05或P<0.01)．结果表明木瓜内生真菌乙酸乙酯萃取部位对胃粘膜损伤有较好的保护作用，其作用机制与其抑制胃粘膜COX-2、H+/K+-ATPase活性和增强PGE2活性有关，然而是木瓜内生真菌乙酸乙酯萃取部位中的何种有效部位/成分起作用及确切的作用机制目前正在进一步研究中．

关键词：木瓜内生真菌；胃粘膜保护作用；H+/K+-ATPase；COX-2；PGE2

木瓜Chaenomelesspeciosa(sweet)Nakaion为我国传统的中药，同时也是民间应用广泛的食材．具有平肝舒筋、和胃化湿之功效，主要用于风湿痹痛、消化不良和胃肠炎等治疗[1]．我们前期研究发现其乙酸乙酯部位和木瓜三萜均具有较好的胃粘膜保护作用[2-4]．本研究拟在此基础上，从其内生真菌代谢产物来研究其对胃粘膜的保护作用．

1材料与仪器

1.1木瓜内生真菌

木瓜内生真菌分离自资丘木瓜的果皮部分，木瓜样品采集于湖北省长阳县榔坪镇．

1.2培养基

马铃薯固体培养基(PDA)：200 g去皮马铃薯捣碎后，煎煮30 min，过滤，取滤液分别加入20 g葡萄糖，20 g琼脂，用蒸馏水定容至1 000 mL，然后在1.25×105Pa压力下，灭菌20 min，即得．

1.3动物

75只体重为18～22 g的雄性SPF级昆明小鼠(购自三峡大学实验动物中心)，动物生产许可证：SCXK(鄂)2011-0012．每笼5只，分开饲养，小鼠在动物中心屏障系统适应环境3天后开始进行实验．

1.4试剂

阿司匹林肠溶片(中国北京拜耳医药保健有限公司)；无水乙醇(国药集团药业股份有限公司)，H+/K+-ATPase试剂盒(南京建成生物制品研究所)，COX-2 ELISA试剂盒(上海岚派生物科技有限公司)，PGE2 ELISA试剂盒(深圳达科为生物技术有限公司)，其它试剂均为市售分析纯．

1.5仪器

电子分析天平(上海天平仪器厂)，Vortex-Genie 2型涡旋振荡器(美国奥然科技有限公司)，酶标仪(瑞士Tecan公司)，脱水机(德国Leica公司)，切片机(奥地利Leica公司)，图像采集系统(德国Leica公司)，倒置显微镜(日本Olympus公司)．

2方法

2.1木瓜内生真菌乙酸乙酯萃取部位的制备

将采集的资丘木瓜依次用5%NaClO溶液和75%酒精表面消毒5 min后，取木瓜果皮接种于PDA培养基中，置于28℃恒温箱中培养．待菌丝长出后，挑取尖端菌丝移至新的PDA培养基上，经几次纯化后得到内生真菌并转接到试管斜面，进行活化，然后选取活化的菌株，接种到含PDA的固体平板上，当菌落生长到Φ大约6 cm，接种至装量为200 mL/500 mL的液体PDA培养基三角瓶中，置旋转式摇床于28℃，120 rpm条件下，培养2～3 d，即得种子液，然后将PDA液体培养基分装于500 mL三角瓶中，装液量为200 mL，发酵200瓶，于121℃、1.25×105Pa下灭菌30 min，然后将种子液按5%的接种量接入已灭菌好的PDA液体培养基中，在温度为28℃，转速为120转/分的摇床中培养20 d，发酵液用纱布过滤后，分为上清液和菌丝体．将菌丝体干燥、粉碎后，用95%乙醇回流提取3次，每次2 h，将提取液和发酵后的上清液合并，减压浓缩得总浸膏，然后将其依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，取乙酸乙酯萃取液浓缩成浸膏，得到木瓜内生真菌乙酸乙酯萃取部位．使用前用0.5%羧甲基纤维钠溶液(0.5%CMC-Na)配成相应浓度的混悬液，备用．

2.2实验分组及胃溃疡模型的建立

将实验小鼠按每组15只完全随机分为空白组、胃溃疡模型组、木瓜内生真菌乙酸乙酯萃取部位(50、100 mg/kg)和奥美拉唑(20 mg/kg)组，给药组灌胃给予相应的药物，空白组和胃溃疡模型组则给予0.5%CMC-Na溶液，每天1次，连续5 d，末次给药1 h后，除空白组外，各组小鼠分别安10 mL/kg灌胃给予阿司匹林的乙醇溶液(15 mg阿司匹林溶解于10 mL 80%乙醇中)，4 h后进行实验．

2.3检测指标

2.3.1溃疡指数的测定

小鼠均颈椎脱臼处死，取胃，肉眼观察胃黏膜外观形态．按照我们已发表文章的方法[2]进行溃疡发生率、溃疡指数和溃疡抑制率的分析．

2.3.2胃粘膜组织中H+/K+-ATPase、COX-2和PGE2活性测定

完成胃粘膜损伤分析后，用载玻片刮取胃粘膜，称量后，按1∶49加入0.9%氯化钠溶液制成匀浆液，离心后，取上清液，按照试剂盒介绍的检测方法测定H+/K+-ATPase、COX-2和PGE2活性．

2.3.3胃粘膜组织形态学观察

取胃窦部分用多聚甲醛(4%)进行固定后，用梯度乙醇脱水后，石蜡包埋，按片后4 μm进行连续切片，然后进行HE，在显微镜下进行形态学分析．

2.4统计学方法

3结果

3.1木瓜内生真菌乙酸乙酯萃取部位对小鼠胃溃疡的影响

由图1可见，空白对照组小鼠胃粘膜呈现淡红色，粘膜皱襞光滑，未见出血点；模型组可见弥散性出血点，腺胃部粘膜出现充血、水肿及糜烂点；木瓜内生真菌乙酸乙酯萃取部位组均可抑制溃疡形成．经胃溃疡指数分析，木瓜内生真菌乙酸乙酯萃取部位(50、100 mg/kg)均可显著减少胃溃疡指数，而且随着剂量的增加，其作用效果更为显著；通过计算分析，木瓜内生真菌乙酸乙酯萃取部位(50、100 mg/kg)对胃溃疡抑制率分别为32.5%、50.3%、62.4%(见表1)．实验结果表明木瓜内生真菌乙酸乙酯萃取部位对乙醇和阿司匹林致小鼠胃溃疡损伤具有较好的保护作用．

表1　木瓜内生真菌乙酸乙酯萃取部位对小鼠胃溃疡的影响±s)

与正常组比较#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较*P<0.05，**P<0.01．

3.2木瓜内生真菌乙酸乙酯萃取部位对胃粘膜组织中H+/K+-ATPase、COX-2和PGE2活性的影响

由表2可见，模型组胃粘膜组织中H+/K+-ATPase和COX-2活性显著升高，PGE2活性明显降低，与正常组比较具有显著性差异(P<0.01)；用木瓜内生真菌乙酸乙酯萃取部位和奥美拉唑治疗后，上述异常变化均得到了显著改善(P<0.05，P<0.01)．

表2　木瓜内生真菌乙酸乙酯萃取部位对胃粘膜组织中H+/K+-ATPase、COX-2和PGE2活性的影响

与正常组比较#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较*P<0.05，**P<0.01．

3.3木瓜内生真菌乙酸乙酯萃取部位对胃粘膜组织形态学的影响

由图2可见，胃粘膜组织经HE染色后，光镜下观察可见，正常组胃粘膜层次清楚，上皮完整，腺体排列整齐，无充血、糜烂现象．模型组胃粘膜可见充血扩张及糜烂性出血，上皮细胞脱落，腺体排列紊乱，并可见炎性细胞浸润．而木瓜内生真菌乙酸乙酯萃取部位和奥美拉唑组胃粘膜未见明显损伤，少见充血扩张及炎性浸润．

A.正常组；B.模型组；C.木瓜内生真菌乙酸乙酯萃取部位50mg/kg组；D.木瓜内生真菌乙酸乙酯萃取部位100mg/kg组；E.奥美拉唑组图2　木瓜内生真菌乙酸乙酯萃取部位对小鼠胃粘膜组织形态学的影响

4讨论

近20年来，随着许多非感染性疾病，如心脑血管疾病、机体衰老等人口的老龄化疾病被相继证实与机体的炎症反应密切相关．近年来，学者们发现阿司匹林等非甾体抗炎药(NSAIDs)可有效降低胃癌、结肠癌等消化道肿瘤的风险和预防心脑血管疾病，使得NSAIDs成为了世界上应用最多的药品之一，在中国其用量仅次于抗感染药物[5]．然而随着其临床应用范围的扩大，NSAIDs相关性胃粘膜损伤的病例也越来越多．尽管临床有铝/铋制剂、H2受体拮抗剂、胃泌素受体及质子泵抑制剂可供选用，但往往由于存在疗效不持久、停药后容易复发、副反应等缺点，使其临床应用受到了极大限制[6-8]．因此，寻找有效防治胃粘膜损伤的措施越来越引起人们的关注．木瓜是常用药食同源药材，在民间应用极为广泛．《本草纲目》记载该药具有舒筋活络、和胃化湿之功，可用于腰酸腿痛、风湿性关节炎等疾病的治疗．我们前期计算分析和实验研究发现，其三萜类成分及其中的齐墩果酸在抗炎的同时，显示出了较好的胃粘膜保护作用[2-4]．根据以上观点，我们进行了木瓜中内生真菌乙酸乙酯萃取部位对胃粘膜损伤的保护作用研究．实验结果表明，木瓜内生真菌乙酸乙酯萃取部位可显著降低胃粘膜组织中H+/K+-ATPase、COX-2活性，升高PGE2活性，降低胃溃疡发生率、胃溃疡指数，升高溃疡抑制率，改善胃粘膜组织形态学，表现出对小鼠胃黏膜损伤良好的保护作用．

现代研究发现胃粘膜有着完善的防御体系，它由粘液-碳酸氢盐-磷脂屏障、上皮细胞屏障和胃粘膜的微循环三级胃粘膜保护屏障组成．在该体系中，攻击因子(H+、胃蛋白酶、H+/K+-ATPase、IL-6、IL-1β、TNF-α、COX-2)和防御因子(COX-1、TGF-β、PG、PGE2)维持着动态平衡，当攻击因子强于防御因子是，胃粘膜表现为胃粘膜损伤[9-10]．防治胃粘膜损伤的根本目的是恢复攻击因子和防御因子间的动态平衡，恢复胃粘膜防御屏障正常功能．在实验中，我们发现，胃溃疡模型小鼠用木瓜内生真菌乙酸乙酯萃取部位治疗后，胃粘膜组织中H+/K+- ATPase、COX-2活性明显降低，PGE2活性显著降低，且具有明显剂量依赖性，该结果也与其改善胃粘膜组织形态学实验结果相一致．

综上所述，木瓜内生真菌乙酸乙酯萃取部位能降低胃粘膜组织中H+/K+- ATPase、COX-2活性，升高PGE2活性，降低胃溃疡发生率、胃溃疡指数，提高胃溃疡抑制率及改善胃粘膜组织形态．其保护作用可能与抑制胃粘膜损伤攻击因子H+/K+-ATPase、COX-2的活性及增强防御因子PGE2活性有关，然而是木瓜内生真菌乙酸乙酯萃取部位中的何种有效部位/成分起作用及确切的作用机制目前正在进一步研究中．

参考文献：

[1]江苏新医学院．中药大辞典[M]．上海：上海人民出版社，1997：349-350．

[2]覃慧林，王爱玲，邓为，等．木瓜乙酸乙酯部位对小鼠急性胃溃疡的保护作用[J]．中药药理与临床，2015，31(2)：45-49．

[3]汪鋆植，闫喜明，田华咏，等.以土家医三元论为指导的反选法在新药研究中的应用[J]．中草药，2015，46(15)：2189-2192．

[4]Wang J Z, Sun W J, Luo H J, et al. Protective Effect of Eburicoic Acid of the Chicken of the Woods Mushroom, Laetiporus Sulphureus (Higher Basidiomycetes), Against Gastric Ulcers in Mice[J]． Int J Med Mushrooms, 2015, 17 (7)：619-626．

[5]Crofford L J. Use of NSAIDs in Treating Patients with Arthritis[J]． Arthritis Res Ther, 2013, 15(3)：S2．

[6]Griffin M R. Epidemiology of Nonsteroidal Anti-inflammatory Drug-associated Gastrointestinal Injury[J]． Am J Med, 1998, 104 (3A)：23S-29S．

[7]Takeuchi K. Pathogenesis of NSAID-induced Gastric Damage： Importance of Cyclooxygenase Inhibition and Gastric Hypermotility[J]． World J Gastroenterol, 2012, 18 (18)：2147-2160．

[8]Davies N M, Smith G D, Windmeijer F, et al. COX-2 Selective Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs and Risk of Gastrointestinal Tract Complications and Myocardial Infarction：an Instrumental Variable Analysis[J]． Epidemiology, 2013, 24(3)：352-362．

[9]Tarnawski A S, Ahluwalia A, Jones M K. The Mechanisms of Gastric Mucosal Injury： Focus on Microvascular Endothelium as a Key Target[J]． Curr Med Chem, 2012,19 (1)：4-15．

[10] Tarnawski A S, Ahluwalia A. Molecular Mechanisms of Epithelial Regeneration and Neovascularization During Healing of Gastric and Esophageal Ulcers[J]． Curr Med Chem, 2012,19 (1)：16-27．

[责任编辑周文凯]

收稿日期：2016-01-04

基金项目：湖北省民间药物工程研究中心(2015ZY007)；三峡大学生物与制药学院预研基金(No. Hy1402)

通信作者：贺海波(1972-)，男，副教授，博士，主要从事土家族药物的活性评价及开发研究．E-mail：hehaibo252219@163.com.

DOI：10.13393/j.cnki.issn.1672-948X.2016.02.021

中图分类号：R282.71

文献标识码：A

文章编号：1672-948X(2016)02-0092-05

Experimental Study of Protective Effect of Gastric Mucosa of Ethyl Acetate Part of Endophytic Fungi fromChaenomelesSpeciosa(sweet) Nakaion

Yan Rongbang1,2Lu Qiaoqiao3He Haibo1Wang Xinyi3Zhang Yongfeng1Qin Huilin1Wang Junzhi1

(1. College of Biology & Pharmacy, China Three Gorges Univ., Yichang 443000, China; 2. Hubei Aerospace Du Le Pharmaceutical Co., Ltd., Yichang 443100, China; 3. Medical College, China Three Gorges Univ., Yichang 443002, China)

AbstractTo investigate the protective effect of gastric mucosa of ethyl acetate part of endophytic fungi from Chaenomeles speciosa (sweet) Nakaion on gastric ulcer injury in mice, and to explore its possible mechanism, the experimental mice were randomly divided into control, model, ethyl acetate part of endophytic fungi from Chaenomeles speciosa (sweet) Nakaion (50 and 100) and omeprazole groups (20mg/kg), 15 mice each group. The gastric ulcers injury were generated by administration of the mixture of ethanol and aspirin which was made up of 10ml 80% ethanol and 15mg aspirin at the 4 hour after drugs on 5th day. The ulcer index, ulcer inhibition rate, histopathological changes, the H+/K+-ATPase, COX-2 and PGE2 activities in gastric mucosa were assessed. The ethyl acetate part of endophytic fungi from Chaenomeles speciosa (sweet) Nakaion (50,100mg/kg) might remarkably decrease H+/K+-ATPase, COX-2 activities, and increase PGE2 in gastric mucosa, ameliorate ulcer index, ulcer inhibition rate, histomorphology (P<0.05 and P<0.01). The ethyl acetate part of endophytic fungi from Chaenomeles speciosa (sweet) Nakaion possess a good protective effect on gastric mucosa injury in mice, inhibiting the activities of H+/K+-ATPase, COX-2, and enhancing PGE2 activity might be one of its molecular mechanisms; but its chemical composition and detailed active mechanisms of toxicity are under studying.

KeywordsEndophytic fungi from Chaenomeles speciosa (sweet) Nakaion;protective effect of gastric mucosa;H+/K+-ATPase;COX-2;PGE2