温度、pH值和碱质量分数对牦牛奶曲拉干酪素提取得率和品质的影响

伍七林，唐善虎，李思宁，王 柳，卢付清，白菊红

（西南民族大学生命科学与技术学院，成都641000）

温度、pH值和碱质量分数对牦牛奶曲拉干酪素提取得率和品质的影响

伍七林，唐善虎，李思宁，王 柳，卢付清，白菊红

（西南民族大学生命科学与技术学院，成都641000）

利用高效液相色谱法对牦牛乳干酪素的5-羟甲基糠醛质量浓度进行测定，评定溶解温度、pH值、碱质量分数对其美拉德反应的影响程度，并筛选出曲拉最佳溶解工艺参数，以提高产品感官品质和提取得率。结果表明，甘孜及周边地区曲拉理化成分较其他地区有所差别。在25～65℃的温度范围内，得率受温度影响差异显著，且感官评分与温度呈负相关，5-HMF质量浓度随着温度上升而增加；在7.5～11.5的pH值范围之内，随着pH值增加，牦牛曲拉干酪素提取得率和5-HMF质量浓度增加，感官评分降低；在8%～24%的碱质量分数范围内，随着碱质量分数的增加，提取得率及5-HMF质量浓度增加，感官评分下降不显著，综合各指标，最佳溶解工艺参数为温度35℃、pH值为10.5和碱质量分数为20%；验证显示，该组合得率达到78.67%±0.31%，感官评分为7.9±0.3，5-HMF检测质量浓度为0.728±0.082 mg/L。该研究建立了一套较优的牦牛曲拉干酪素提取工艺，为曲拉干酪素有效提取及品质检测提供了新方法。

牦牛干酪素；提取；美拉德反应；5-羟甲基糠醛

0 引言

干酪素的主要成分是酪蛋白，呈白色或微黄色、无臭味的颗粒状物质，其极高的营养价值以及良好的功能特性被广泛应用于食品、造纸、制革、涂料、化妆品等行业［1-2］。我国生产工业干酪素的主要原料是“曲拉”［3］。在曲拉制备干酪素的过程中，由于工艺条件的限制，高温和高pH值环境使获得的牦牛干酪素外观呈现出色泽暗黄、变褐，酸度和粘度下降以及气味不佳等现象，引起产品功能特性、感官品质低下等问题，不能满足市场对干酪素应用的需求［4］，成为经济效益和市场竞争的最大阻碍。

本研究针对曲拉制备干酪素过程当中出现的色泽品质和得率低的问题，在加入抗氧化剂的情况下，利用高效液相色谱法测定5-羟甲基糠醛的质量浓度，确定牦牛曲拉干酪素褐变程度。并探讨了曲拉溶解因素对干酪素褐变程度、得率及品质的影响，筛选出干酪素提取的最佳溶解工艺参数，对干酪素的生产制备提供理论支撑及参考意义。

1 实验

1.1 材料与试剂

奶干渣；乙醚，石油醚，硫酸铜，浓硫酸，四硼酸钠，氢氧化钠，盐酸，草酸，三氯乙酸，Na2S2O4（保险粉）以上试剂均为分析纯；甲醇（色谱纯），5-羟甲基糠醛（标准品）。

1.2 仪器与设备

Agilent 1100高效液相色谱仪；Kjeltec2200自动凯氏定氮仪；MP511 Lab pH Meter；PL303分析天平；Centrifuge 5804R高速冷冻离心机；DZ350台式真空包装机。

1.3 方法

1.3.1 曲拉成分测定

检测曲拉中水分、蛋白质、灰分、脂肪的质量分数参考国家标准［5-8］。

1.3.2 干酪素提取工艺

1.3.2.1 牦牛曲拉制备干酪素流程

原料检验→粉碎→搅拌溶解→过滤→离心脱脂→点酸→洗涤→离心脱水→造粒→干燥→包装→成品

1.3.2.2 干酪素提取方法

［9］中的方法并加以修改。具体方法如下：①溶解曲拉：称取定量样品后加入保险粉（每8 g加入0.15g），料液比为1∶20，升温至45℃后，缓慢滴加质量分数为16%的NaOH溶液并搅拌，至pH值达到指定值即可。②过滤、离心脱脂：用200目滤布过滤，弃去滤渣，离心处理（4 500 r/min，45℃）。③点酸：缓慢滴加质量分数10%的HCl，调节pH值至4.6左右，缓慢搅拌使酪蛋白完全凝固析出，过滤得酪蛋白凝固物。④清洗、离心脱水：用40℃的温水，搅拌清洗5 min，重复洗涤3次，在转速为3 000 r/min下离心脱水30 min。⑤造粒：将酪蛋白凝固物过20目网筛造粒。⑥干燥：将上述干酪素放入40℃鼓风干燥箱干燥30 min，在干燥过程中对其进行翻转，使其干燥均匀，即得产品。

1.4 实验设计

1.4.1 单因素试验设计

（1）温度对得率及美拉德褐变反应程度的影响。参照1.3.2.2干酪素提取方法，分别控制溶解温度梯度为25，35，45，55，65℃；研究不同溶解温度对干酪素得率及其美拉德褐变反应程度的影响。

（2）终点pH值对得率及美拉德褐变反应程度的影响。参照1.3.2.2干酪素提取方法，分别控制最终滴加pH值的梯度为7.5，8.5，9.5，10.5，11.5；研究不同的溶解终点pH值对干酪素得率及其褐变反应程度的影响。

（3）碱浓度对得率及美拉德褐变反应程度的影响。参照1.3.2.2干酪素提取方法，分别控制溶解所添加的NaOH溶液质量分数梯度为8%，12%，16%，20%，24%；研究不同碱液质量分数对干酪素得率和美拉德褐变反应程度的影响。

1.4.2 正交实验设计

在单因素的试验基础上，根据正交试验设计原理，以温度、pH值、碱液浓度作为试验主要因素，试验的正交因素与水平表见表1。

表1 牦牛曲拉碱溶正交实验因子与水平

1.5 指标测定

1.5.1 产率

产率=干酪素质量（g）/曲拉质量（g）×100%。

1.5.2 感官鉴定

参照甘伯中［9］干酪素感官评分标准。

1.5.35 -羟甲基糠醛测定

参考文献［10］中高效液相色谱法测定5-HMF质量浓度的方法，并加以修改。

1.5.3.15 -羟甲基糠醛标准溶液配制

5-羟甲基糠醛储备液：准确称取5-羟甲基糠醛2 mg，用蒸馏水定容到10 mL（棕色），配制成质量浓度为200 μg/mL的储备液。

5-羟甲基糠醛标准溶液：制备质量浓度分别为0.4，0.8，1.6，3.2，6.4 μg/mL的标准溶液。

1.5.3.2 样品的预处理

准确称取2 g固体样，加入浓度为0.15 mol/L的草酸，充分震荡后放入沸水浴中加热25 min，冷却后加入质量分数为40%三氯乙酸，充分震荡后，离心并收集上清液，向剩余沉淀中加入10 mL 4%的三氯乙酸，步骤同上，把两次收集的上清液混合，过0.22 μm滤膜，待测。

1.5.3.3 色谱条件

色谱柱：Waters Symmetry C18色谱柱（4.6 mm× 250 mm，5 um）。流动相：A甲醇、B为水（体积比15∶85），紫外检测波长为284 nm，进样量20 uL，柱温为35℃，流速为0.8 mL/min。

1.6 数据处理

在试验过程中，每个处理重复3次；对测定数据采用SPSS19.0软件进行平均数和标准差计算，并对正交试验结果进行方差分析，不同显著性的数据以不同的字母或者星号标记。

2 结果分析与讨论

2.1 曲拉成分质量分数

本研究曲拉样品水分、蛋白质、脂肪、灰分质量分数如表2所示。

由表2可以看出，曲拉水分质量分数为11.6%。有相关研究表明西藏地区曲拉水分3%～10%［11］，青海海南地区、黄南地区和果洛地区曲拉水分质量分数分别为14.38%，12.51%和14.38%［12］。各地区曲拉水分质量分数存在差异的主要原因是空气水分活度不同和曲拉制作工艺上存在差异。在曲拉贮藏过程中，其水分质量分数是影响曲拉质量的重要因素。主要体现在以下两点：一是水分质量分数过大，曲拉本身发生化学反应，如美拉德反应，脂肪氧化等，在贮藏过程中发生严重的褐变、氧化酸败；二是水分质量分数大，容易感染微生物，微生物污染相应带来的化学反应导致曲拉的POV值升高、酸度上升，从而影响曲拉质量。

经测定，蛋白质质量分数为67.4%，而根据张洋［11］对曲拉的理化特性研究，西藏多数地区的曲拉中蛋白质质量分数为30%～40%。不同地区的曲拉蛋白质质量分数相差较大，与原料、工艺、当地环境密不可分。经索氏抽提法测定其脂肪质量为4.9%，比西藏地区报道的2.3%～3.2%高出较多，产生的原因是牧民在制作曲拉的过程中工艺不尽相同，在离心方式的选择上各有差异，是地区与地区脂肪含量不同的重要因素。灰化法测定灰分的质量分数为5.1%，与其他地区曲拉中灰分含量无明显差异。

2.2 5-HMF浓度标准曲线

根据以上1.5.3的方法进行色谱测定，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制5-HMF标准曲线，得到质量浓度与峰面积的线性关系，其线性回归方程为：y（峰面积）=158.06x-6.6597，相关系数R2=0.9996。

2.3 温度的影响

温度对曲拉干酪素提取得率、感官品质以及5-HMF质量浓度的影响如表3所示。

由表3可以看出，温度在25～65℃范围内，随着溶解温度升高，得率先升高后降低，低于55℃时得率升高，在55℃得率达到最大，为90.60%，各处理组之间差异显著（P＜0.05），65℃时得率降低，处理组之间差异不显著（P＞0.05）。可见随着温度的增加，溶解速率和溶解程度都相应的增加，反之温度过低，会降低溶解反应速率，这与之前纪银莉［13］等报道的一致。同时，加热可以分解蛋白质，产生小分子聚物，增加蛋白质的溶解性，但是加热时间过长或温度过高，小分子可溶蛋白聚集成大分子蛋白，从而降低了溶解度［14-16］。

表2 曲拉组分及质量分数%

表3 溶解温度对得率、感官品质、5-羟甲基糠醛质量浓度的影响

表4 pH值对得率、感官评分、5-羟甲基糠醛质量浓度的影响

随着温度的升高感官评分逐渐降低，当温度超过55℃时，下降程度增大，在65℃时感官评分最低，为4.7，且各处理组感官评分在温度变化时差异显著（P＜0.05）。表明温度是影响干酪素感官品质的重要原因，温度越高，褐变程度增大，感官评分越低，这与孟岳成［17］等报道的一致。

美拉德反应是羟基化合物（还原糖）和胺基化合物（氨基酸）缩合形成希夫碱，经环化、重排形成Amadori化合物的过程，Amadori化合物由不同的途径分解，最终生成棕色或黑色的类黑精物质，5-羟甲基糠醛是美拉德反应的中间产物，它的含量可以揭示其褐变程度［17-19］。当温度在25℃和35℃时，5-羟甲基糠醛质量浓度分别为0.211 mg/L和0.479 mg/L，处理组之间差异不显著（P＜0.05），可能是由于低温时美拉德反应程度较低，保险粉对美拉德反应的抑制作用进一步降低产物形成。当温度在45℃～65℃时，5-羟甲基糠醛质量浓度增幅加大，在65℃时，5-HMF质量浓度值最高达到12.158 mg/L，且处理组之间差异显著（P＜0.05）。张兰威［18］等研究发现，温度升高会促进酪蛋白中的赖氨酸与还原糖发生美拉德反应，使得产品中积累的5-羟甲基糠醛增多。可见随着温度的增加，5-羟甲基糠醛质量浓度增加，美拉德反应程度增加。

2.4 pH值的影响

pH值对曲拉干酪素提取得率、感官品质以及5-HMF质量浓度的影响如表4所示。

由表4可以看出，当pH值为7.5时，得率最低，为42.36%，在pH值为11.5时，达到最大为84.08%，各处理组在终点pH值升高时得率总体上升（P＜0.05）。可见随着终点pH值升高，曲拉的溶解程度增加，得率升高；同时，终点pH值降低，曲拉溶解不彻底，得率偏低。可见随着pH值升高溶解速率和溶解性都升高。

当pH值为7.5时，感官评分最高为9.6，在pH值为11.5时，感官评分最低为6.3，且各处理组间差异显著（P＜0.05），可见随着碱溶pH终点的逐渐增大，感官评分逐渐降低。

表4结果显示，当pH值升高时，整体上5-HMF含量增加，美拉德反应程度增加。美拉德反应的羰氨缩合是一个可逆的过程，羰基和氨基随着体系氢离子浓度的变化进行不同程度的离子化，氨基在较低的pH环境中质子化，不能进行亲核进攻，只有不带电的少数能与羰基缩合，酸性环境中羰氨缩合速率很低［20］。可见在碱性环境中，羟氨缩合速率较大。羰氨缩合之后，糖通过反醇醛、烯醇化和脱水反应进行讲解，这些反应都是具有碱催化作用的，所以美拉德反应速度和程度随着pH的升高而增大［21］。当碱溶在pH值为7.5～10.5范围时，5-HMF质量浓度增加缓慢且5-HMF检测值较低，差异不显著（P＞0.05）。导致这一结果的可能原因有二：其一，可能是亚硫酸盐与羰基化合物发生加成反应，降低了中间产物的活性；其二，可能是保险粉的还原性、亚硫酸盐的耗氧和降低pH值的作用阻碍了美拉德反应的发生。在pH值为11.5时，5-HMF增加明显，差异显著（P＜0.05），原因可能是随着碱液的加入，保险粉活性降低，美拉德反应程度增加所致。

表5 碱质量分数对提取得率、感官评分、5-羟甲基糠醛质量浓度的影响

表6 不同正交组合处理对提取得率、感官评分、5-HMF质量浓度的影响

2.5 碱质量分数的影响

碱质量分数对曲拉干酪素得率、感官品质以及5-HMF质量浓度的影响如表5所示。

由表5可以看出，随着碱质量分数的增加，产品的得率整体上逐渐升高，在碱质量分数为24%时，干酪素得率达到最大（73.88%），但是各处理组之间差异不显著（P＞0.05）。根据Ivan Bonizzi［22］和高芸芳［23］等人提出酪蛋白由四种单体分别为αs1-酪蛋白、αs2-二酪蛋白、β-酪蛋白和K-酪蛋白组成，这4种单体通过αs-螺旋、β-折叠和β-转角等结构构成了酪蛋白的空间结构。其中β-折叠结构是酪蛋白二级结构的主要成分，主要存在于蛋白分子疏水区域，随着碱质量分数的增加，局部碱浓度过大，pH值升高，酪蛋白分子的二级结构发生明显变化，其β-折叠含量先增后降，疏水作用降低［24］。在蛋白分子通过疏水部分之间的疏水作用自组装生成胶束时，β折叠结构遭到破坏α-螺旋和转角的含量增加［25-26］。结果表明：随着碱浓度的增加，引起局部pH值偏高，产品得率略微增加，同时局部碱浓度过高引起局部蛋白质的结构变化，对蛋白质的内部结构破坏程度也加重。

当碱质量分数为8%时，感官评分最高，为9.6，同时感官品质整体上随着碱浓度的增加呈下降趋势，且各处理组之间差异显著（P＜0.05），当碱浓度为24%时，评分最低，为6.3。原因可能是碱质量分数较低时，局部pH值较低，褐变程度低，在碱质量分数较高时，局部碱质量分数增加，褐变程度高所致。

随着碱质量分数的增加，5-羟甲基糠醛整体上质量浓度先减后增，碱质量分数8%的5-HMF检测值较16%的高。原因在于当碱浓度处于较低水平时，加热时间的延长使美拉德反应产物不断增加［27-28］。当碱质量分数为12%和16%时，5-羟甲基糠醛质量浓度分别为0.629 mg/L和0.903 mg/L，差异不显著（P＞0.05），当碱浓度大于16%时，5-HMF含量迅速增加，差异显著（P＜0.05），可见局部碱浓度升高，pH值增加，美拉德反应程度加深。

2.6 正交实验结果分析

2.6.1 溶解工艺条件正交优化实验结果

根据表1设计，以感官评定、5-HMF值为依据，干酪素得率为参考指标，对溶解工艺当中的温度、pH值以及碱质量分数进行极差和方差分析，结果如表6所示。

由表6可以看出，各因素对得率影响的主次因素是：B＞C＞A，终点pH值是影响得率的主要因素，得率最优组合为A3B3C3。影响感官品质的主次因素：A＞B＞C，温度和终点pH值是影响感官评分的主要因素，感官品质最优组合为A1B1C2。影响5-HMF质量浓度的主次因素为：B＞A＞C，温度是影响5-HMF质量浓度的主要因素，5-HMF质量浓度最优组合为A1B1C3。

2.6.2 各因素趋势

图2 正交实验各因素趋势

图2为正交实验各因素趋势。由图2可以看出，5-羟甲基糠醛质量浓度和得率整体呈不断上升趋势，且5-羟甲基糠醛质量浓度上升幅度较大，产率上升幅度较小，而感官评分呈不断下降趋势。在温度为55℃时，5-羟甲基糠醛和得率达到最大值，分别是12.716 mg/L和81.60%。且溶解温度各水平对产品的感官品质的影响较大，差异显著（P＜0.05）。综上分析，试验水平选择溶解温度为35℃，即A1，与于淼［14］报道的温度基本一致。

当终点pH值为9.5时，5-羟甲基糠醛质量浓度最低，感官评分最高，而产率最低，分别为0.606 mg/L，7.33，69.27%。当终点pH值为11.5时，5-羟甲基糠醛质量浓度最高，感官评分最低，而得率最高，分别为14.334 mg/L，5.40，89.49%。随着终点pH值的不断升高，整体上干酪素得率和5-羟甲基糠醛质量浓度不断上升，感官评分不断下降，且溶解终点pH值各水平之间对得率、感官品质的影响较大，差异显著（P＜0.05），而对5-羟甲基糠醛质量浓度影响无显著差异（P＞0.05）。综上分析，在保证得率和感官的情况下，试验水平应选择终点pH值为10.5，即B2。与甘伯中［2］报道的pH值基本一致。

随着碱质量分数的增加，整体上得率先下降后上升、感官评分呈上升趋势，且5-羟甲基糠醛质量浓度先上升后下降，但各处理组间差异不显著（P＞0.05）；当碱浓度为20%时，5-羟甲基糠醛最低为1.516 mg/L，此时感官评分为6.5，得率最大为81.51%，综合考虑试验水平应选择碱浓度为20%。

3 结论

（1）环境、原料以及工艺不同生产的牦牛乳曲拉在水分、蛋白质以及脂肪质量分数不一致；

（2）从曲拉中提取干酪素的得率与温度、终点pH值以及碱浓度呈正相关。随着温度、终点pH值、碱质量分数的增加，产品的得率逐渐升高；感官品质与温度、pH值以及碱浓度呈负相关，且感官质量与5-HMF质量浓度呈负相关（P＜0.05）。

（3）经过正交实验对提取工艺优化，确定最佳工艺组合为A1B2C3，即温度35℃、pH值为10.5和碱质量分数20%；经过3次试验验证该组合产率达到75.67%±0.31%，感官品质评分为7.9±0.3，5-HMF质量浓度为0.728±0.082（mg/L）。

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Effect of the temperature，pH value and alkali concentration on the of extraction yield and quality of casein from yak milk Qula

WU Qi-lin，TANG Shan-hu，LI Si-ning，WANG Liu，LU Fu-qing，BAI Ju-hong
（College of Life science and Technology，Southwest University for Nationalities，Chengdu 641000，China）

HPLC was used for the measurement of 5-hydroxymethyl furfural content of yak milk casein to evaluate the extension of Maillard reaction.Solution temperature，pH value，and concentration of alkali were considered for the Maillard reaction，extraction yield and sensory evaluation.To improve the sensory quality of products and the extraction rate，dissolution process parameters were screened and optimized.The results showed that the percentage of moisture，protein，fat，ash in Qula in the area of Ganzi and its surrounding area were different from others.In the range of 25～65℃temperature，the extraction rate increased.At 55℃reached the maximum rate，90.60%. Extraction rate was significantly affected by temperature and sensory evaluation and temperature showed negative correlation，the content of 5-HMF with the temperature rise and increased；at a range of pH value 7.5～11.5，with the increase of pH value，yak milk casein extraction yield and 5-HMF content increasedand sensory score was lower；in the range of 8%～24%alkali concentration，the extraction rate and 5-HMF content increased and sensory score declined，but was not significant.Based on comprehensive consideration，optimal dissolution process parameters for casein extraction were:temperature 35℃，pH10.5 and alkali concentration of 20%；after repeated three times to verify that the combination，the extracted rate reached 78.67±0.31%，sensory score was 7.9±0.3，and 5-HMF content was 0.728± 0.082（mg/L）.The study has established a better yak milk casein extraction method，and provides a new technology for effective extraction of Qula casein and quality detection.

yak casein；extraction；maillard reaction；5-hydroxymethyl furfural

TS252.59

A

1001-2230（2016）08-0021-05

2016-02-29

研究生创新型项目（CX2015SZ094）；国家科技支撑计划项目（2015BAD29B02）；四川省科技支撑计划（2014NZ0011）。

伍七林（1991-），男，硕士研究生，从事食品加工与安全方面的研究。

唐善虎