解毒化瘀方药物血清与药物血浆对模型PC12细胞蛋白酶活化受体-1、细胞外信号调节激酶1/2表达的影响

邓奕辉，李银，谭琥，覃弘宇，李定祥

湖南中医药大学中西医结合心脑疾病防治湖南省重点实验室，细胞生物学与分子技术湖南省高校重点实验室，湖南 长沙 410208

解毒化瘀方药物血清与药物血浆对模型PC12细胞蛋白酶活化受体-1、细胞外信号调节激酶1/2表达的影响

邓奕辉，李银，谭琥，覃弘宇，李定祥

湖南中医药大学中西医结合心脑疾病防治湖南省重点实验室，细胞生物学与分子技术湖南省高校重点实验室，湖南 长沙 410208

目的比较解毒化瘀方药物血清与药物血浆对凝血酶合并缺氧诱导PC12细胞损伤蛋白酶活化受体（PAR）-1、细胞外信号调节激酶（ERK）1/2表达的差异。方法灌胃给药制备大鼠药物血清和药物血浆。采用三气培养箱和无糖DMEM培养液造成细胞缺氧模拟缺血，并同时加入150 U/mL凝血酶，建立体外缺氧合并凝血酶诱导的PC12细胞损伤模型。实验分为空白组、模型组、药物血清组及药物血浆组。实时荧光定量PCR检测细胞PAR-1、ERK1/2 mRNA表达，免疫荧光法检测细胞PAR-1、ERK1/2蛋白表达。结果与空白组比较，模型组PAR-1、ERK1/2 mRNA和蛋白表达增强（P＜0.05）；与模型组比较，药物血清组和药物血浆组PAR-1、ERK1/2 mRNA和蛋白表达下降（P＜0.05，P＜0.01）；药物血浆组PAR-1、ERK 1/2表达较药物血清组下降（P＜0.05）。结论解毒化瘀方药物血浆抗缺氧合并凝血酶诱导PC12细胞损伤作用优于其药物血清。

解毒化瘀方；药物血浆；药物血清；PC12细胞；大鼠

中药血清药理学是指将中药或中药复方经口给动物灌服一定时间后采集动物血液、分离血清，用此含有药物成分血清进行体外实验的一种实验技术［1］。然而，近年来不少学者发现，中药复方或单味药药物血清与血浆在成分和作用上存在差异，且在大多数情况下，中药药物血浆较药物血清具有优势。

近年来，急性缺血性中风的中医病机理论取得重大突破，其中王永炎院士提出的“毒损脑络”病机假说得到了广泛的研究［2-6］。本课题组认为，缺血性中风主要病机瘀血阻滞、毒损脑络的形成与凝血酶毒性相关，化瘀解毒法是该病的有效治法。解毒化瘀方为基于“瘀毒”理论的中药复方，由黄连、黄芩、黄柏、栀子等8味中药组成。而凝血酶正是通过与蛋白酶活化受体（protease-activated receptor，PAR）结合发挥对神经细胞的毒性作用，同时，细胞外信号调节激酶（ERK）1/2系统在凝血酶诱导的脑耐受中发挥重要作用。故基于本课题组前期体外缺氧合并凝血酶诱导PC12细胞损伤模型的建立，研究该方药物血清与药物血浆对上述模型PAR-1、ERK1/2 mRNA和蛋白表达的差异，为血浆药理学方法的提出提供依据。

1 实验材料

1.1 动物

SPF级SD大鼠32只，5周龄，体质量180～200g，雌雄各半，湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号SCXK（湘）2013-0005。饲养于室温18～20 ℃、湿度65%～70%环境，自由饮水饮食。

1.2 实验细胞

PC12细胞，来源于大鼠的肾上腺嗜铬细胞瘤细胞，高分化、永生性，长沙赢润生物技术有限公司，编号2015032007。

1.3 药物及制备

解毒化瘀方（黄连9g，黄芩6g，黄柏6g，栀子9g，红花9g，川芎12g，赤芍12g，地龙9g）饮片购自湖南省中医药研究院附属医院中药房。第1次加4倍量蒸馏水，煎煮1 h，滤出煎液，第2次加2倍量蒸馏水，煎煮30 min，合并2次煎液，过滤浓缩至2g/mL原药材药液，4 ℃冰箱保存备用。

1.4 主要试剂与仪器

DMEM高糖培养基，美国HyClone公司；胰蛋白酶，Sango公司；链霉素青霉素混合溶液（100 U/mL青霉素、100g/L链霉素）、磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2），GIBICO公司；胎牛血清，美国HyClone公司。凝血酶，中国Solarbio试剂公司；Trizol，Invitrogen公司；SYBR Green PCR试剂盒，Thermo公司，批号#K0223；反转录试剂盒，Fermentas公司，批号#K1622；一抗-蛋白酶活化受体（PAR-1），sc-13503，Santa Cruz公司；二抗-TRITC标记山羊抗小鼠IgG，CW 0152，康为世纪公司；一抗-p44/42MAPK（ERK1/2），#9102，Santa Cruz公司；二抗-TRITC标记山羊抗兔 IgG，CW 0160，康为世纪公司。普通CO2培养箱（德国贺利氏，Heracell），三气培养箱（Thermo，3131），Real-time检测仪（ABI公司，ABI-7300），低温冷冻离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司，TG-16M），电动匀浆机（FLUKO，PRO200），旋涡振荡器（青浦泸西仪器厂，K30），激光共聚焦显微镜（日本奥林巴斯，CSC6F24407）。

2 实验方法

2.1 药物血清与药物血浆制备

SD大鼠适应性饲养7 d，随机分为空白血浆组、空白血清组、药物血浆组、药物血清组，每组8只，药物血浆组和药物血清组每日给予解毒化瘀方煎液36.4g/kg灌胃（按动物体表面积剂量换算，相当于5倍临床等效剂量），空白血浆组和空白血清组予等量蒸馏水灌胃。药液浓度为2g/mL，每只给药体积按36.4g/kg换算，每日1次，连续7 d。末次给药前禁食12 h，末次给药后1 h，腹腔注射10%水合氯醛（1mL/250g）麻醉，无菌条件下腹主动脉采血。血清组所采血液置于普通采血管，37 ℃水浴30 min，置于4 ℃冰箱过夜，凝固后3000 r/min离心15 min，取上清液为血清。血浆组所采血液置于抗凝管内（所含抗凝剂为1.5%EDTA-Na2，血液∶抗凝剂=9∶1），轻颠3次，使抗凝剂与血液充分混合，3000 r/min离心15 min，取上清液为血浆。将制备好的血清与血浆过滤除菌后分装，置于-80 ℃冰箱保存备用。

2.2 PC12细胞培养及缺氧缺血损伤模型的建立

PC12细胞用10%胎牛血清，1%100 U/mL青霉素、100g/L链霉素混合溶液，90%DMEM高糖培养基配成的完全培养液培养于37 ℃、5%CO2及饱和湿度培养箱中，2 d换液1次，待细胞成长融合后传代培养。细胞以1×105个/mL接种于96孔培养板，每孔0.18mL，培养24 h待细胞完全贴壁后再加终浓度为50 μg/L神经生长因子诱导分化72 h［7］弃原培养液，加入含150 U/mL凝血酶的无血清低糖培养基，置于三气培养箱中（5%CO2、1%O2、94%N2）培养模拟缺氧缺血过程，12 h后取出。

2.3 分组

取诱导分化72 h后、融合80%以上PC12细胞进行实验，随机分为空白组、模型组、药物血浆组和药物血清组。模型组、药物血浆组和药物血清组均需加入含150 UU/mL凝血酶的无血清低糖培养基，置于三气培养箱中培养，空白组加入完全培养液普通培养箱培养。12 h后，弃原培养液，模型组、药物血浆组和药物血清组分别加入完全培养液、含10%药物血浆完全培养液、含10%药物血清完全培养液，空白组则加入等量完全培养液，均置于普通培养箱培养24 h后备检。

2.4 指标检测

2.4.1 实时荧光定量PCR检测细胞蛋白酶活化受体-1、细胞外信号调节激酶1/2 mRNA表达 引物合成：引物设计合成纯化均由Invitroggen Biotechnnology Co.，LTD中国公司完成，所用引物见表 1。细胞总RNA的提取：按照试剂盒说明提取细胞RNA，紫外分光度计测定RNA纯度，并进行RNA定量。PCR条件：95 ℃℃预变性10m in，95 ℃变性15 s，60 ℃复性45 s，60 ℃延伸1 min，40个个循环。PCR产物分析：取 PPCR产物琼脂糖凝胶中电电泳，紫外灯下观察条带，数据采用仪器自带软件ABBI Prism 7300 SDS Software分析。各标本重复3次，取其平均值。

表1 PCR引物序列

2.4.2 免疫荧光法检测细胞蛋白酶活化受体--1、细胞外信号调节激酶 1/22蛋白表达 取各组细胞，吸去培养基后PBS洗3次次×10 min，加4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗3次×10 min，加加0.5%Triton穿孔10 min，PBBS洗3次×10 min，加5%胎牛血清封闭30 min，加一抗（1∶2000封闭液稀释），4 ℃过夜，PBS洗3次×100 min，加TTRITC标记的抗小鼠荧光二抗（1∶50封闭闭液稀释），室温避光30 min，PBS洗3次× 10 min，加HHoechst332588（1∶200）核染10 min，PBS洗3次×100 min后，加甘油封片，于激光共聚焦显微镜下观察，以平均荧光强度值反映蛋蛋白的表达强度。

3 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行分析。实验结果以

4 结果

4.1 解毒化瘀方药物血清与药物血浆对模型大鼠蛋白酶活化受体-1、细胞外信号调节激酶 1/2 mRNA表达的影响

与空白组比较，模型组 PAR-1、ERK1、ERK2 mRRNA表达增增强（P＜0.011）；与模型组比较，药物血清组和药物血浆组PAR-1、ERK1、ERK2 mRNA表达下降（P＜00.05，P＜0.001）；药物血浆组 PAR-1、ERRK1、ERK2mRNA表达较药物血清组下降（P＜0.005）。结果见表2。

表2 各组细胞PAR-1、ERK1、ERK2 mRNA表表达比较（±s）

表2 各组细胞PAR-1、ERK1、ERK2 mRNA表表达比较（±s）

注：与空白组比较，▲▲P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与药物血清组比较，#P＜0.05（下同）

组别 n组PAR-1ERK1ERK2空白组 3 0.003 8±0.000 5 0.008 8±0.000 50.026 0±0.004 6模型药物药物组 3 0.05血清组 3 0.02血浆组 3 0.01 3 6±0.008 6▲▲0 7 4±0.003 4**0 4 6±0.004 8**#0 .060 8±0.007 8▲.049 8±0.007 0*.029 7±0.001 9**▲0.174 7±0.025 0.104 2±0.016#0.067 7±0.012 0▲▲5*4**#

4.2 解毒化瘀方药物血清与药物血浆对模型大鼠蛋白酶活化受体-1、细胞外信号调节激酶1/2蛋白表达的的影响

与空白组比较，模型组PAR-1、ERK1/2蛋白表达增强（P＜0.011）；与模型组比较，药物血清组和药物血浆组PAR-1、、ERK1/2蛋白表达下降（P＜0.05，P＜0.001）；其中，药药物血浆组PAR-1、ERK1/2蛋白表达较药药物血清组下降（P＜0.05）。结果见表3、图1、图2。

表3 各组细胞PAAR-1、ERK1/2蛋白表达比较（±s，平均荧光强度）

表3 各组细胞PAAR-1、ERK1/2蛋白表达比较（±s，平均荧光强度）

组别 n PAR1ERK1/2空白组 33.753 2±0.445 86.950 0±1.684 0模药药型组 3物血清组 3物血浆组 3 15.818 7±0 8.761 7±1 6.729 0±0 .350 7▲▲ 2 .348 6** 1 .530 5**# 1 0.696 7±1.808 6 4.900 0±0.975 4 1.395 0±1.231 1▲▲* **#

图1 PAR-1蛋白表达荧光图（×600）

图22 ERK1/2蛋白表达荧光图（×600）

5 讨论

中药血清药理学不仅具有体外实验的优点，如条件可控性强，可以进行大量的药理效应实验观察，较整体动物容易控制，并可在细胞、亚细胞水平进行超微、生化、受体、基因等方面的研究，揭示药物作用机理较为深入，重复性好，使用材料少等，而且避免了中药粗制剂直接进行体外实验的缺陷，更加接近中药经消化吸收后在体内产生的作用。然而，经消化道吸收的中药有效成分在体内进入的是血浆，而非血清。不同于血浆，血清是血液凝固后除去纤维蛋白与血细胞的液体成分，血液凝固过程及其激发的一系列生物学反应不仅明显改变了血液成分，而且对中药成分与其派生物质可能产生影响。2003年，有学者查阅我国大量发表的有关“血清药理学”的论著，发现绝大部分其实是“血浆药理学”，只有少部分是真正的血清药理学［8］；同时也有学者从血液生理的角度通过实验研究认为，某些情况下血浆药理学方法能更好地再现体内环境中产生的药理效应［9］。因此，贺氏等［10］提出了“血浆药理学方法”。

近年来，凝血酶在急性缺血性中风发生发展中的作用受到了学术界的重视，凝血酶不仅是血液凝固、血栓形成的关键水解酶，而且也通过与 PAR结合发挥对神经细胞的毒性作用。因此，以凝血酶为靶点来研究急性缺血性中风具有重要价值。PAR介导的凝血酶反应在脑损伤中具有双重作用，凝血酶在低浓度时诱导脑耐受性，而在高浓度时对脑细胞产生毒性效应而加重对脑组织的损害，以上过程是通过信号转导来实现的。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPKs）是细胞内的一类丝/苏氨蛋白激酶，可将胞外刺激信号传递给胞核，导致细胞应激和损伤反应。ERK是MAPK家族的一员，属丝/苏氨酸蛋白激酶，正常定位于胞浆，当激活后转位至胞核，调节转录因子活性，产生细胞效应。ERK家族有 5个亚族，包括ERK1～ERK5，其中ERK1/2系统在凝血酶诱导的脑耐受中发挥重要作用。ERK1/2磷酸化可促进神经细胞存活，但持续的磷酸化能导致细胞的凋亡。

本研究采用实时荧光定量PCR及免疫荧光法检测解毒化瘀方药物血清与药物血浆对凝血酶合并缺氧诱导PC12细胞损伤模型PAR-1、ERK1/2 mRNA和蛋白表达的影响。实验结果表明，药物血浆抗凝血酶合并缺氧诱导PC12细胞损伤作用强于药物血清。这可能是因为血液通过凝血形成血清的过程中，激活了许多酶类物质以及血小板和白细胞，这些活性物质可能会产生能降解中药有效成分的作用。同时，凝血过程中形成的纤维蛋白及其网络的血细胞很可能会吸附或结合一些中药有效成分，从而减少中药有效成分，造成效应减弱。因此，对于使用药物血浆和药物血清均可的实验，药物血浆能更真实地反映药物疗效。

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Effects of Jiedu Huayu Prescription Containing Serum and Plasma on PAR-1 and ERK 1/2 of PC12 Cell Model

DENG Yi-hui， LI Yin， TAN Hu， QIN Hong-yu， LI Ding-xiang
（Key Laboratory of Hunan Province for Prevention and Treatment of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine on Cardio-cerebral Diseases， Key Laboratory of Hunan Universities for Cell Biology and Molecular Techniques， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China）

ObjectiveTo compare the differences betweenJiedu HuayuPrescription containing serum and plasma on PAR-1， ERK1/2 expression of the PC12 cell injury model.MethodsRat serum containing and plasma models was prepared through gavage. Three gas incubators and sugar-free DMEM medium simulated ischemia caused by hypoxia were used， and 150 U/mL of thrombin was added， with a purpose to establish the thrombin-induced hypoxic PC12 cell injury model. The experiment was divided as control group， model group， serum containing group and plasma containing group. Real-time fluorescent quantitative PCR was used to detect the expression levels of PAR-1 and ERK1/2 mRNA in each group； immunofluorescence was used to detect the protein expressions of PAR-1 and ERK1/2.ResultsCompared with the control group， the expressions of PAR-1 and ERK1/2 mRNA and protein in model group were enhanced （P＜0.05）； compared with the model group， the expressions of PAR-1 and ERK1/2 mRNA and protein in serum containing group and plasma containing group decreased （P＜0.05，P＜0.01）； the expressions of PAR-1 and ERK1/2 mRNA and protein in plasma containing group decreased more significantly than serum containing group（P＜0.05）.ConclusionJiedu HuayuPrescription containing plasma was superior to its containing serum against the injury of PC12 cell induced by hypoxic and thrombin.

Jiedu HuayuPrescription； plasma containing medicine； serum containing medicine； PC12 cells； rats

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.06.019

R285.5

A

1005-5304（2016）06-0073-04

2015-10-24）

（

2015-11-17；编辑：华强）

国家自然科学基金（81373508）；湖南省自然科学基金（13JJ6061、14JJ2113）；湖南省中医药科研基金资助项目（201319）；湖南省教育厅资助项目（12A105）；湖南省重点学科中西医结合基础资助项目（2011-2015）；湖南省自然科学创新群体基金（2012年）；湖南省高校科技创新团队（2012年）

李定祥，E-mai l：ldxlzy@hotmail.com