蜘蛛香中总环烯醚萜及2个指标性成分ba ld rina l和11-ethoxyvibu rtina l含量测定

李萍，闫兴丽，高增平，施金钹，杨贝贝，季文琴，孟庆卿，王宝华

1.北京中医药大学中药学院，北京 100102；2.北京中医药大学基础医学院，北京 100029

蜘蛛香中总环烯醚萜及2个指标性成分ba ld rina l和11-ethoxyvibu rtina l含量测定

李萍1，闫兴丽2，高增平1，施金钹2，杨贝贝1，季文琴1，孟庆卿1，王宝华1

1.北京中医药大学中药学院，北京 100102；2.北京中医药大学基础医学院，北京 100029

目的建立蜘蛛香药材中总环烯醚萜类成分及 2种环烯醚萜类成分 baldrinal（缬草醛）和11-ethoxyviburtinal（环戊烷-吡喃-7-甲醛，4-乙氧基甲基）的含量测定方法，并测定3个产地蜘蛛香药材中的成分含量。方法采用紫外分光度法，以11-ethoxyviburtinal为对照品，在波长288 nm处测定总环烯醚萜的含量；采用高效液相色谱法测定baldrinal和11-ethoxyviburtinal的含量，采用Phenomenex Luna C18色谱柱，以乙腈-磷酸水为流动相，流速为0.95mL/min，检测波长为288 nm，柱温为30 ℃。结果蜘蛛香中总环烯醚萜类成分的浓度在2.088～14.616 μg/μL范围内线性关系良好，baldrinal、11-ethoxyviburtinal分别在74.88～224.64 μg、41.6～249.60 μg范围内线性关系良好，方法精密度、重复性、稳定性、加样回收率均良好。结论本方法准确、简便、快速，可用于蜘蛛香药材的质量控制。

蜘蛛香；紫外分光度法；高效液相色谱法；环烯醚萜类成分；含量测定

蜘蛛香为败酱科缬草属植物Valeriana jatamansiJones的干燥根茎及根，主产于四川、贵阳等地，始载于《本草纲目》，具有理气止痛、消食止泻、祛风除湿、镇惊安神功效，用于脘腹胀痛、食积不化、腹泻痢疾、风湿痹痛、腰膝酸软、失眠［1］。现代研究发现，蜘蛛香中含有许多化学成分，其中环烯醚萜类化合物为蜘蛛香的主要有效成分。药理研究表明，蜘蛛香环烯醚萜类成分具有抑制胃肠功能亢进、降低内脏敏感性、改善精神状态的作用，并具有良好的镇痛作用［2-3］。2010年版《中华人民共和国药典》将缬草三酯和乙酰缬草三酯作为其含测指标［1］，但此类化合物不稳定，其结构中有许多活泼的官能团，在酸、热、光的影响下，易发生开环、断键和某些重排反应而降解［4］，而经过乙醇回流提取可将缬草素类成分转化为较稳定的降解产物 baldrinal（缬草醛）和11-ethoxyviburtinal（环戊烷-吡喃-7-甲醛，4-乙氧基甲基）。有关蜘蛛香总环烯醚萜类成分的含量测定至今未见报道，为深入研究蜘蛛香的药理活性成分及其质量标准，首先需建立该类化合物的含量测定方法。本研究采用紫外分光度法检测蜘蛛香总环烯醚萜类成分，高效液相色谱法（HPLC）测定2个指标性成分baldrinal、11-ethoxyviburtinal的含量，为进一步完善蜘蛛香药材的质量控制标准提供依据。

1 仪器与试药

岛津LC-20AT高效液相色谱仪（日本岛津公司）：SPD-20A二级阵列检测器（PDA），SIL-20A自动进样器，DGU-20A5在线脱气机，CTO-10ASvp柱温箱和岛津LC-solution工作站；TU-1810型紫外-可见分光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；DJ-04型粉碎机（上海淀久中药机械制造有限司）；Sartorious BT 25S型1/100000电子分析天平（北京赛多利斯仪器有限公司）。

11-ethoxyviburtinal对照品、baldrinal对照品，北京中医药大学中药学院制药教研室自制，HPLC测定含量均≥98%；3批蜘蛛香药材分别购自四川、云南、贵州，经北京中医药大学中药学院生药系石晋丽教授鉴定，均为败酱科缬草属植物Valeriana jatamansiJones的干燥根茎及根。乙腈为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，乙醇、甲醇均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 总环烯醚萜类成分含量测定

2.1.1 对照品溶液与供试品溶液的制备 精密称取干燥至恒重的11-ethoxyviburtinal对照品2.60 mg，置25mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得对照品溶液。蜘蛛香药材粉碎，过24目筛，取粉末5.0g，精密称定，置圆底烧瓶中，加70%乙醇200mL，浸泡1 h，加热回流提取12 h，放置冷却，补足减失的质量，过滤，取续滤液1mL置100mL容量瓶中，加70%乙醇稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

2.1.2 测定波长的选择 取“2.1.1”项下对照品溶液、供试品溶液及空白对照，在200～800 nm波长范围内进行扫描，结果供试品溶液与对照品溶液的吸收曲线基本一致，在288 nm处有最大吸收波长，且无干扰，故选择288 nm为最大吸收波长。

2.1.3 线性关系考察 精密吸取“2.1.1”项下对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mL，置5mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。以甲醇为空白，在288 nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程：Y=0.047 2X+ 0.028 7，r=0.999 9，表明在2.088～14.616 μg/mL范围内线性内关系良好。

2.1.4 精密度试验 精密吸取“2.1.1”项下对照品溶液，连续测定6次，计算RSD=0.06%，结果表明精密度良好。

2.1.5 稳定性试验 精密吸取“2.1.1”项下对照品溶液，在0、10、20、30、40、50、60 min分别测定吸光度，结果显示在60 min内基本稳定，RSD=0.57%（n=7），表明稳定性良好。

2.1.6 重复性试验 精密称取同一批蜘蛛香药材粉末6份，每份约5.0g，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，分别进行测定，结果RSD=1.98%，表明重复性良好。

2.1.7 加样回收率试验 精密称取同一批已知含量的蜘蛛香药材粉末6份，分别精密加入对照品溶液，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，测定含量，计算平均回收率及RSD。结果总环烯醚萜的平均回收率为101.21%，RSD=1.54%，见表1。表明本方法回收率较好，测定结果可靠。

表1 加样回收率试验

2.2 baldrinal和11-ethoxyviburtinal含量测定

2.2.1 对照品液与供试品溶液的制备 分别精密称取干燥至恒重的baldrinal和11-ethoxyviburtinal对照品2.34、2.60 mg，分别置于25mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，分别取5mL置于25mL容量瓶中，定容至刻度，即得混合对照品溶液，baldrinal、11-ethoxyviburtinal的浓度分别为18.72、20.8 μg/mL。蜘蛛香药材粉碎，过24目筛，取粉末5.0g，精密称定，置500 mL圆底烧瓶中，加70%乙乙醇200mL，浸泡1 h，加热回流提取12h，放置冷却却，补足减失的质量，过滤，取续滤液，过过0.45 μm微孔滤膜，即得得。2.22.2 色谱条条件与系统统适用性试验验 色谱柱：Phenomenex Luuna C18柱（55 μm，4.6 mmm×250 mmm）；流动动相：乙腈（A）-0.1%磷磷酸水（B），梯度洗脱（00～15min，35%A；15～30 min，30%A）；流速速：0.95mL/mmin，柱温：30 ℃；进样量：200 μL；检测波长：288 nmm。分别精密吸取20 μL对照品溶液和供试品溶液进样，balldrinal和 111-ethoxyviburrtinal的保留时间分别约约为16、24 min，与其他组分分离较好（R＞＞1.5），色谱谱图见图1。

图1 蜘蛛香中baldrinal、11-ethoxyviburtinaa l HPLC图

2.2.3 线性关系考察 精密吸取“2.2.1”项下混混合对照品溶液2、4、6、8、10、12 μL依次进样，按“2.2.2”项下条件进测定定。以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，计算回归方方程。baldrinal、11-ethooxyviburtinal的回归方程分别为 Y=4 7993 006.52X++5375.24（rr= 0.9999 9）、Y=55 247 320.066X-185.80（r=0.999 9））。结果表明，baaldrinal和 111-ethoxyviburtinal分别别在74.88～224.64μg、41.60～～249.60 μg范范围内呈良好的线性关系。

2.2.4 精密度试验 按““2.2.1”项下下方法制备的的供试品溶液，精密吸取20 μLL注入液相色谱仪，连续进样6次，测定峰面积，balddrinal和11-eethoxyviburtiinal峰面积的RSD分别为0.622%和0.53%，结果表明在在此条件下仪器精密度良好。

2.2.5 重复性试验 取同一批次蜘蛛香药材 6份份，按“2.2.1”项下下方法制备供试品溶液，分别进样并计算含含量，结果baldrinal和11-ethoxyvibburtinal的RRSD分别别为1.26%、、0.37%，表表明该方法重复性良好。

2.2.6 稳定性试验 取同一供试品溶液，在室温温下放置置，分别于0、4、8、122、24 h进样样分析并计算含量，结果baldrrinal和11-eethoxyviburtiinal的RSD分别为2.12%、0.200%，表明供试试品溶液室温温下24 h内稳定。。

2.2.7 加样回收率试验 精密称取已知知含量的样品6份，，分别精密加加入 baldrinaal和 11-ethooxyviburtinall对照品溶液，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，测定2种成分的含含量，计算平均回收率及RSD，结果见表2。

表2 加样回收率试验

2.3 样品含量测定

取四川、云南、贵州3个产地的蜘蛛香药材粉末，按“22.1.1”项下方方法制备供试试品溶液，测测定总环烯醚醚萜含量；另取3个个产地的蜘蛛香药材粉末末，按“2.2.1””项下方方法制备供试试品溶液，分分别进样测定定，按外标一点法分分别计算balldrinal和11-ethoxyviburttinal的含量。结果见表3。

表33个产地蜘蛛香香药材中指标成分分含量测定结果（mg/g，n=3）

3 讨论

近年来，蜘蛛香的相关报报道很多，缬草素类成分分不耐热、易酸水解［5］，本试验采用加热回流的方式，使缬草素类成分分解为其稳定的降解产物。

本试验对 5%%香兰素冰醋酸法、对二甲氨基苯甲醛法作作了考察，其显色不明显显且不稳定，，紫外-可见分光光度计在2000～800 nm范范围内扫描，2种显色方法对照品以及样品最大吸收均均不一致，而在不显色的的情况下，对照品与样品在2888 nm处有最大吸收，且方法稳定可靠。本本试验还考察了以甲醇-水水、甲醇-磷磷酸水、乙腈-水和乙腈-磷酸水系统作为流动相的色谱行为，甲醇-水系统对baldrinal和11-ethoxyviburtinal的分离效果较差，而乙腈-磷酸水系统的分离度较好，克服了拖尾现象，故选用乙腈-磷酸水系统作为流动相，并经试验确定采用梯度洗脱法分离效果较好。

本试验对蜘蛛香中总环烯醚萜及 baldrinal和11-ethoxyviburtinal的含量进行测定，建立了既简便、易行，又能同时测定该类成分总含量及2个指标性成分的质量控制方法，为制定药材及其制剂相应的质量标准提供了可靠的参考。根据3个产地蜘蛛香药材含测定的数据，蜘蛛香中总环烯醚萜及2种活性成分含量存在一定差异，可能与产地及储存时间有关系，这对蜘蛛香药材产地的选择有一定意义。

［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部［M］.北京：中国医药科技出版社，2010：345-346.

［2］ 樊江波.蜘蛛香治疗肠易激综合征的作用和机制研究［D］.北京：北京中医药大学，2008.

［3］ 闫兴丽，洪缨，石晋丽，等.蜘蛛香环烯醚萜对肠易激综合征模型大鼠5-HT和5-HIAA的影响［J］.中国中药杂志，2011，36（9）：1235-1238.

［4］ 陈玉娟，石晋丽.蜘蛛香中缬草素在不同溶媒中的稳定性研究［J］.北京中医药大学学报，2009，32（5）：349-350.

［5］ 狄宏晔，石晋丽，闫兴丽，等.蜘蛛香药材质量标准研究［J］.中国中药杂志，2007，32（22）：2357-2359.

Content Determ ination of Total Iridoid Compounds and Baldrinal and 11-ethoxyviburtinal from Valerianae Jatamansi Rhizoma et Radix

LI Ping1， YAN Xing-li2， GAO Zeng-ping1， SHI Jin-bo2，YANG Bei-bei1， JI Wen-qin1， MENG Qing-qing1， WANG Bao-hua1
（1. School of Chinese Materia Medica， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China； 2. School of Basic Medicine， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China）

ObjectiveTo establish a method for content determination of total iridoid compounds and baldrinal and 11-ethoxyviburtinal from Valerianae Jatamansi Rhizoma et Radix； To determine the contents of total iridoid compounds and baldrinal and 11-ethoxyviburtinal in Valerianae Jatamansi Rhizoma et Radix from three medicinal origins.MethodsUV spectrophotometry was applied， 11-ethoxyviburtinal （cyclopentane-pyran-7-formaldehyde，4-ethoxy methyl） was set as the reference substance， and the content of total iridoid compounds was determined at 288 nm. HPLC method was used to simultaneously determ ine the contents of baldrinal and 11-ethoxyviburtinal. The HPLC analysis was performed on a Phenomenex Luna C18column （250 mm×4.6 mm， 5 μm）. The mobile phase was composed of acetonitrile-water in gradient elution at a flow rate of 0.95mL/min. The detection wavelength was 288 nm and the column temperature was 30 ℃.ResultsThe total iridoid compounds， baldrinal and 11-ethoxyviburtinal were in good linearity within the ranges of 2.088–14.616 μg/μL， 74.88–224.64 μg， and 41.6–249.6 μg， respectively. This method was precise， and with good repeatability， stability and recovery rate.ConclusionThe method is accurate，simple， rapid， which can be used for the quality control of Valerianae Jatamansi Rhizoma et Radix.

Valerianae Jatamansi Rhizoma et Radix； UV； HPLC； total iridoid compounds； content determ ination

R284.1

A

1005-5304（2016）06-0088-04

2015-07-16）

（

2015-09-14；编辑：陈静）

国家自然科学基金（81073132、81357070）；北京中医药大学基本科研业务费项目（2015-JYB-XS036）

王宝华，E-mai l：wbaohua1@163.com

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.06.023