大鼠Hes1腺病毒干扰载体构建及功能鉴定*

周学亮，方义湖，赵 勇，邹 斌，徐 华，吴起才，刘季春

(南昌大学第一附属医院心脏大血管外科,南昌 330006)

论著·基础研究

大鼠Hes1腺病毒干扰载体构建及功能鉴定*

周学亮，方义湖#，赵 勇，邹 斌，徐 华，吴起才，刘季春△

(南昌大学第一附属医院心脏大血管外科,南昌 330006)

目的 构建高滴度大鼠Hes1腺病毒干扰载体(Ad-Hes1-shRNA)。方法 设计3对Hes1-shRNA寡核苷酸序列，通过定向克隆构建pHBAd-U6-CMV-Hes1-shRNA干扰质粒，将pHBAd-U6-CMV-Hes1-shRNA和pHBAd-BHG共转染293T细胞，以包装Ad-Hes1-shRNA，利用改进TCID50法进行病毒滴度测定。Ad-Hes1感染H9c2心肌细胞，Western blot检测Hes1表达。结果 pHBAd-U6-CMV-Hes1-shRNA构建成功，Ad-Hes1-shRNA包装顺利，滴度为1.0×1011PFU/mL，并可在H9c2心肌细胞内发挥干扰效应。结论 Ad-Hes1-shRNA包装成功，在心肌细胞中具有Hes1的干扰效应。

腺病毒科；RNA干扰；寡核苷酸序列分析；Hes1；质粒构建；病毒包装

发状分裂相关增强子-1(hairy and enhancer of split 1,Hes1)作为经典的抑制型碱性螺旋-环-螺旋(basic helix loop helix,bHIJH)基因，激活后可有效拮抗激活型bHLH基因的表达水平[1]；同时作为Notch信号通路靶基因，在减轻心肌缺血再灌注损伤中发挥了重要调节作用[2]。本研究拟采用腺病毒载体系统，通过设计针对大鼠Hes1基因干扰序列，构建Hes1腺病毒干扰载体(Ad-Hes1-shRNA)，并感染H9c2心肌细胞，筛选干扰大鼠Hes1基因最佳的Ad-Hes1-shRNA，为进一步观察Hes1信号通路在心肌细胞的作用奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞及菌株 293T细胞购于中科院上海生命科学院细胞库，DH5α超级化学感受态细胞购于Invitrogen公司。

1.1.2 大鼠cDNA文库及腺病毒载体系统 大鼠cDNA文库来购于大连TaKaRa公司；pHBAd-U6-CMV载体、pHBAd-BHG骨架质粒购于汉恒生物科技有限公司。

1.1.3 主要试剂 限制性内切酶(BamHⅠ、EcoRⅠ)购于New England Biolabs公司，T4 DNA Ligase购于Fermentas公司，质粒小/中量提取纯化试剂盒、DNA纯化试剂盒、DNA凝胶回收与纯化试剂盒购于康为世纪有限公司，LipofiterTM购于为汉恒生物科技有限公司，细胞裂解液购于碧云天生物技术研究所，Hes1单克隆鼠抗购于Abcam公司，β-actin单克隆鼠抗购于Anbo公司，HRP标记的羊抗兔IgG购于北京中杉金桥生物技术有限公司，增强化学发光底物购于Pierce Biotechnology公司。

1.1.4 引物设计与合成 针对大鼠Hes1基因，设计3对Hes1-shRNA寡核苷酸序列(Hes1:5′-CCG GGC AAG AAT AAA TGA AAG TTT G-3′;N1ICD-shRNA-2:5′-CAG ACA TTC TGG AAA TGA CAG TGA A-3′;N1ICD-shRNA-3:5′-CCT CTG AGC ACA GAA AGT CAT CAA A-3′)，分别插入BamHⅠ与EcoRⅠ酶切位点，交上海桑尼生物技术有限公司合成3对寡核苷酸，规格为2A。

1.2 方法

1.2.1 pHBAd-U6-CMV-Hes1-shRNA干扰质粒构建及筛选 将3对寡核苷酸退火形成双链，T4 DNA Ligase连接BamHⅠ与EcoRⅠ双酶切后的双链Oligonucleotide、pHBAd-U6-CMV。将3组连接产物转化DH5α化学感受态细胞，接种于Amp+(氨苄西林)的LB培养基平板，次日随机挑选阳性单克隆菌落，摇菌过夜，菌液送上海桑尼生物技术有限公司基因测序，序列无误后分别命名为pHBAd-U6-CMV-Hes1-shRNA-1、pHBAd-U6-CMV-Hes1-shRNA-2、pHBAd-U6-CMV-Hes1-shRNA-3。

1.2.2 Ad-Hes1-shRNA包装、收毒、扩增及滴度测定 将pHBAd-U6-CMV-Hes1-shRNA 2 μg、pHBAd-BHG 4 μg共转染293细胞，6 h后更换新鲜细胞培养液。每天观察细胞出毒迹象，出毒完毕后收集所有细胞及培养液，于-80 ℃和37 ℃间冻融3次，3 000 r/min离心5 min，上清液即为Ad-Hes1第一代毒种(P1)，作为毒种-80 ℃保存。取P1代毒种感染293细胞，待所有细胞脱落底面开始收毒，2 000 r/min离心5 min，弃上清液，加入1 mL ST buffer(培养液+10%血清+2.5%甘油)，Votex混匀，于-80 ℃和37 ℃间冻融3次，3 000 r/min离心5 min，取上清液(P2)-80 ℃保存。依前法利用P2代病毒大量扩增病毒，纯化后利用改良TCID50法行病毒滴度测定。

1.2.3 Ad-Hes1-shRNA功能鉴定 H9c2细胞传代107至6孔板，每孔分别加入约Ad-NC、Ad-Hes1-shRNA-1、Ad-Hes1-shRNA-2、Ad-Hes1-shRNA-3，4 h更换培养液，36 h后收集细胞蛋白，Western blot 检测Hes1表达。

2 结 果

2.1 pHBAd-U6-CMV-Hes1-shRNA干扰质粒成功构建 DNAMAN比对分析pHBAd-U6-CMV-Hes1-shRNA阳性转化子菌液基因测序结果，与Hes1-shRNA基因序列完全一致(图1)。

2.2 Ad-Hes1-shRNA包装、收毒、扩增及滴度测定 HBAd-U6-CMV-Hes1-shRNA、pHBAd-BHG 共转293细胞后，每天显微镜下观察细胞出毒迹象，出毒现象为细胞变大变圆，呈葡萄状，并开始出现明显噬斑，待细胞大部分病变并从底部脱落进行收毒，待细胞大部分病变并从底部脱落进行收毒(图2)。利用改进TCID50法测定Ad-Hes1-shRNA滴度，结果为1.0×1011PFU/mL，体积1 mL，总滴度为1.0×1011PFU。

图1 Hes1-shRNA基因测序图

图2 显微镜下Ad-Hes1-shRNA细胞出毒情况(×20)

A：Hes1蛋白Western blot；B：Hes1蛋白灰度值。1：模拟感染组；2：Ad-Hes1-shRNA-1;3:Ad-Hes1-shRNA2;4:Ad-Hes1-shRNA-3。

图3 Ad-Hes1-shRNA在H9c2心肌细胞内的干扰效应

2.3 Ad-Hes1功能鉴定 构建成功的Ad-Hes1-shRNA干扰质粒转染293T细胞，48 h后提总蛋白，Western blot显示Ad-Hes1-shRNA-2、Ad-Hes1-shRNA-3均可达到满意的干扰效果，以Ad-Hes1-shRNA-2干扰效果最强，见图3。

3 讨 论

Hes1的功能研究目前大多集中在神经发育、体节形成、骨骼发育、T 淋巴细胞发育等四个方面[3]。最近研究证明Hes1在心脏发育中具有重要调节作用，积极影响心室流出道的发育成熟[4]。Bhoopathi等[5]发现Hes1基因表达可以显著促进内源性Stat3的酪氨酸磷酸化水平，并且在表皮生长因子诱导下，Hes1基因的表达使得Stat3更易转运进入细胞核，增加DNA与Stat3的结合活性。在作者前期研究中，同样发现作为Notch1信号通路靶基因，Hes1通过类似途径促进Stat3磷酸化，从而激活SAFE信号通路，发挥强大的心肌保护作用。Hes1无特异性抑制剂，特异性抑制Hes1并非易事，因此利用RNAi技术，针对特定Hes1蛋白构建相应干扰载体，可达到特异性抑制Hes1的作用。

RNA干扰技术是一种由内源性或者外源性双链DNA介导的转录后水平的基因沉默技术[6-7]。短发卡RNA(shorthairpin RNA,shRNA)是根据siRNA设计的类似双链结构的RNA，相比于siRNA，其在随载体进入细胞时具有更高的内在稳定性，并且shRNA在细胞内可以由单个模板快速合成大量的shRNA，其沉默作用更加持久[8]。目前，用于目的基因转移的病毒载体主要包括腺病毒、腺相关病毒、反转录病毒和慢病毒载体[9]。与其他基因载体系统相比，腺病毒载体具有宿主范围广、可感染静止及分裂期细胞、感染率高，靶细胞内多拷贝高效表达，理化性质稳定，遗传毒性较低，包装容量大及不整合等优点，已在基因载体领域应用广泛[10]。因考虑后期研究涉及细胞及动物实验，对病毒感染效率要求高，因此作者采用腺病毒载体系统构建Hes1干扰载体。

在Ad-Hes1-shRNA构建过程中，作者先用合成3对Hes1-shRNA的寡核苷酸，退火形成双链后利用定向克隆技术，构建HBAd-U6-CMV-Hes1-shRNA，再与pHBAd-BHG共转染293T细胞进行病毒包装，细胞出毒后收集第一代(P1)毒液，并以此为毒种进行第二代(P2)出毒及大量病毒扩增，病毒滴度测定后，再感染H9c2心肌细胞，以筛选干扰效果最佳的Ad-Hes1-shRNA，从而为Hes1对缺血心肌细胞保护作用的机制研究奠定了实验基础。

[1]Tian C,Tang YJ,Wang TT,et al.HES1 is an Independent prognostic factor for acute myeloid leukemia[J].Onco Targets Ther,2015,8(10):899-904.

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Construction and functional identification of rat Hes1 adenovirus interference vector*

ZhouXueliang,FangYihu#,ZhaoYong,ZouBin,XuHua,WuQicai,LiuJichun△

(DepartmentofCardiovascularSurgery,TheFirstAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang,Jiangxi330006,China)

Objective To construct the high titers rat Hes1 adenovirus interference vector (Ad-Hes1-shRNA).Methods 3 pairs of Hes1-shRNA oligonucleotide sequences were synthesized to construct the pHBAd-U6-CMV-Hes1-shRNA interference plasmid by directly clone.pHBAd-U6-CMV-Hes1-shRNA and pHBAd-BHG plasmids were co-transfected into 293 cells to Ad-Hes1-shRNA,virus titer are determined by modified TCID50.Hes1 was detected by Western blot after Ad-Hes1-shRNA infected with H9c2 myocardial cells.Results pHBAd-U6-CMV-Hes1-shRNA was constructed successfully,Ad-Hes1-shRNA packaging smoothly with 1.0×1011PFU/mL titer,which can play the interference effect in the H9c2 myocardial cells.Conclusion The Ad-Hes1-shRNA is successfully packaged and has the interference effect of Hes1 in myocardial cells.

adenoviridae;RNA interference;oligonucleotide array sequence analysis;Hes1;plasmid construction;virus packaging

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.34.002

国家自然科学基金资助项目(81570262)；赣鄱555领军人才计划(赣组字[2013]58号)；江西省自然科学基金重大项目(20152ACB20026)。作者简介：周学亮(1980-)，副主任医师，博士，主要从事心肌疾病的信号通路研究#共同第一作者：方义湖(1971-)，教授，博士，主要从事心脏病理方面研究。△

,E-mail:liujichun999@163.com。

R654.2

A

1671-8348(2016)34-4757-03

2016-07-20

2016-09-08)