针刺对Y123F雄性肥胖小鼠糖脂代谢及瘦素的影响

万钰茜,陈梁,沈卫东(.上海中医药大学,上海 003;.上海中医药大学附属曙光医院,上海 003)

针刺对Y123F雄性肥胖小鼠糖脂代谢及瘦素的影响

万钰茜1,陈梁1,沈卫东2
(1.上海中医药大学,上海 201203;2.上海中医药大学附属曙光医院,上海 201203)

目的探讨针刺干预对Y123F雄性肥胖小鼠的体重、糖脂代谢及肝脏的影响。方法将11只小鼠随机分为两组,实验组6只,对照组5只,实验组选取中脘和双侧后三里穴进行13 d的针刺干预,对照组与实验组以同样的方式固定,但不针刺。结果实验组小鼠的体重、血糖、血清瘦素水平与对照组比较,均有显著性差异(P＜0.05);而高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、甘油三酯(TG)以及总胆固醇(TC)水平与对照组比较,则无统计学差异(P＞0.05)。结论针刺干预能够有效改善Y123F雄性小鼠的肥胖程度、高血糖、血清高瘦素水平,并改善肝脏质量,但对小鼠脂代谢并无明显改善。

Y123F小鼠;瘦素;肥胖;针刺;糖脂代谢

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effect of acupuncture intervention on body weight,glycolipid metabolism and the liver inmale obese Y123Fmice.M ethodElevenm icewere random ized into two groups,an experiment group of 6mice and a control group of 5m ice.In the experimentgroup,point Zhongwan(CV12)and bilateralpoints Housanli(ST36)were given 13 days of acupuncture intervention.In the control group,m ice were fastened in the same way as in the experiment group but not given acupuncture.ResultTherewere statistically significant differences in body weight,and blood sugar and serum leptin levels(P＜0.05)but no statistically significant differences in high density lipoprotein(HDL-C),low density lipoprotein(LDL-C)and triglyceride(TG)(P＞0.05)between the experiment and control groups.ConclusionAcupuncture intervention can effectively reduce the degree of obesity and high blood sugar and serum leptin levels and improve liver quality but notmarkedly ameliorate lipidmetabolism inmaleY123Fm ice.

[Keywords]Y123Fm ice;Leptin;Obesity;Acupuncture;Glycolipidmetabolism

随着肥胖人群的日趋增多,胰岛素抵抗、2型糖尿病、高血压等多种肥胖相关性疾病的发病率逐年升高,据世界卫生组织(WHO)统计,肥胖者发病死亡率远高于正常体重患者[1],因此肥胖已成为近年医学界研究的热点。针灸作为一种传统的治疗方法,在对肥胖及其伴随症状的治疗方面具有独特的优势[2-5],针灸减肥作用机制很多,如中枢神经调节、体液调节、免疫调节等[6-9],其中中枢神经调节机制是目前的研究热点。主流思想认为,针刺对肥胖机体作用主要通过对神经系统、内分泌系统、消化系统的调整,减少能量的摄入,增加能量的消耗,纠正代谢异常及失衡状态,从而达到减肥的目的[10]。Y123F小鼠是中科院营养所刘勇研究组利用基因敲入技术,将瘦素受体基因中,三个酪氨酸(Y)位点985、1077和1138位突变为苯丙氨酸(F),该小鼠表现为血清高瘦素水平,血糖、血脂高及脂肪肝症状,成年后肥胖和生殖功能异常[11]。本实验以Y123F雄性成年肥胖小鼠为动物模型,选取中脘和双侧后三里穴进行13 d的针刺干预,观察针刺干预后小鼠的体重,糖脂代谢,血清瘦素水平以及肝脏组织的变化,探讨针刺对糖脂代谢的调节作用以及对瘦素水平的影响。

1　材料与方法

1.1实验动物

采用基因敲入技术,将C57BL小鼠瘦素受体Ob-Rb的胞内端985、1077和1138位的三个酪氨酸(Y)都突变为苯丙氨酸(F),培育出品系为Y123F的瘦素受体点突变小鼠模型,纯合子雄性成年小鼠,野生型小鼠选取相同周龄成年C57BL/6雄性小鼠,由上海市计划生育科学研究所施惠娟课题组提供。饲养温度(23±3)℃,湿度(35±5)%。昼夜12 h进行循环,早晨6:30为亮灯时间,饲养用食物为符合国际标准的普通食物,购于上海普路腾生物科技有限公司。所有小鼠实验操作均遵循Insti tutional Animal Care以及Use Commit tee of the Inst itute for Nut ri tional Sciences有关细则。

1.2器械

一次性无菌针灸针(0.18 mm×13 mm)。

1.3仪器设备

ZHWY-211 Incubator Shaker(Hangzhou Chincan Trading Co.,Ltd.);MK3型酶标仪[赛默飞世尔(上海)仪器有限公司];移液器(上海华运分析仪器有限公司);电子计重天平(上海友中衡电子有限公司);电子天平仪器(普力斯特/PTY-A60)。

1.4试剂

葡萄糖测定试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司);人甘油三酯(TG)ELISA试剂盒(上海研谨生物科技有限公司);人高密度脂蛋白(HDL)ELISA试剂盒(上海拜力生物科技有限公司);人低密度脂蛋白(LDL) ELISA检测试剂盒[卡迈舒生物技术(上海)有限公司];人总胆固醇(TC)ELISA检测试剂盒(上海研辉生物科技有限公司);瘦素检测试剂盒(上海睿廷生物科技有限公司)。

1.5实验方法

将11只纯合子小鼠随机分为两组,实验组6只,对照组5只。针刺时间固定在每日中午13:00—16:00,由专人操作。

将实验组小鼠放入自制的小鼠固定器中,用75%乙醇棉球消毒后,采用直径0.18mm针灸针直刺双侧后三里穴3 mm,中脘穴3 mm,由固定的实验员行针,以小鼠胡须轻微抖动为宜,每隔1min行针1次,每次1min,每穴刺激时间为10 min,每日1次,连续治疗13 d。

对照组小鼠采取同样的方式每日固定10 min。环境温度控制在25～30℃,所有小鼠均采用同样的饲料喂养,自由摄食和饮水。

1.6指标检测

实验过程中,每天更换小鼠的食物和水,记录小鼠的饮食和饮水量,每日13:00记录小鼠的体重。实验结束后第2天小鼠断食6 h,眼眶取血,4℃放置过夜,分离血清与血浆,采用酶联检测法,测定血清中葡萄糖、甘油三酯、总胆固醇、高低密度脂蛋白及瘦素含量。

1.7肝脏组织的HE染色

1.7.1肝脏的固定与石蜡切片

取小鼠肝脏组织块(约200 mg)在10%中性福尔马林中固定过夜后,在浓度由低到高的一系列乙醇溶液中逐渐脱去组织中的水分。再将组织块置于二甲苯中替换出其中的乙醇。加热石蜡块,将已经透明的组织块置于已经融化的石蜡中,放入融蜡箱中保温,待石蜡完全侵入组织块。准备组织包埋容器,倒入已经融化的石蜡,迅速夹取已经浸透石蜡的组织块放入其中。冷却后,凝固成块即可。将包埋好的蜡块固定于切片机上,切成8mm厚薄片,漂在热水中烫平后,贴到载玻片上,置于45℃烘箱中烘干。

1.7.2石蜡切片的HE染色

上述制作好的石蜡切片在二甲苯中脱蜡5～10 min,移入二甲苯和纯乙醇(1:1)混合液中5 min,再依次经过100%、95%、85%、70%各级乙醇,分别放置2～5 min,最后经蒸馏水转入染液。苏木精染液染色5～15 min,水洗玻片上多余染液,0.5～1%盐酸乙醇溶液(70%乙醇配制)分色片刻。镜检控制,直至细胞及核内染色质清晰为止,约数10秒钟。流水冲洗15～30min,蒸馏水短洗。放入0.1～0.5%伊红染液染色1～5min(每100mL染液中加入1～2滴冰醋酸)。然后依次经过70%、85%、95%、100%的各级乙醇溶液脱水,分别放置2～3min(在95%以下浓度的乙醇溶液中伊红易脱色,应适当缩短时间)。二甲苯透明2次,共约10 min。最后进行封片,擦去切片周围多余二甲苯,迅速滴加适量中性树胶,再加盖玻片封固。放置片刻后,于镜下检测。

1.8统计学方法

采用SPSS16.0统计软件进行数据分析,各组数据符合正态分布,实验数据以平均值±标准差表示。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1针刺干预后小鼠体重变化

在为期13 d的针刺过程中,实验组小鼠体重较对照组有明显的下降。详见表1。

表1各组干预后小鼠体重变化　(±s,g)

表1各组干预后小鼠体重变化　(±s,g)

注:与对照组比较1)P＜0.01

组别　n　　干预前　　干预后　　体重改变值实验组　6　38.42±5.78　37.58±5.84　　﹣0.67±1.541)对照组　5　35.90±5.35　38.80±5.24　6.13±2.98

2.2针刺干预后小鼠血糖的变化

Y123F小鼠表现为高血糖状态,针刺后实验组小鼠血糖降低,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05),与野生型相比差异无统计学意义(P＞0.05)。详见表2。

表2　各组干预后小鼠血糖的变化　(±s,mmol/L)

表2　各组干预后小鼠血糖的变化　(±s,mmol/L)

注:与对照组比较1)P＜0.05

组别　n　　血糖实验组　6　4.43±1.951)对照组　5　8.69±2.79野生型　4　2.91±0.00

2.3针刺干预后小鼠血脂的变化

Y123F小鼠同时也表现为高血脂状态,针刺后实验组小鼠高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)与对照组比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。详见表3。

表3　各组干预后小鼠血脂的变化　(±s,mmol/L)

表3　各组干预后小鼠血脂的变化　(±s,mmol/L)

组别　　高密度脂蛋白 低密度脂蛋白　　总胆固醇　　甘油三酯实验组　1.16±0.18　1.83±0.48　2.86±0.35　1.70±0.62对照组　1.33±0.35　1.85±0.44　3.20±0.52　1.10±0.20

2.4各组小鼠肝脏病理学变化

2.4.1肉眼观察

实验组小鼠肝脏肝色暗红,边缘钝厚,质地柔韧。对照组小鼠肝脏外观与实验组小鼠肝脏区别不大,体积增大,边缘钝厚,质地变软。

2.4.2光镜观察

实验组小鼠可见零星脂肪空泡。对照组小鼠脂肪变细胞体积增大,胞浆内可见数量不等、大小不一的脂肪空泡,胞核被推向周边,呈气球样变。详见图1、图2。

图1　实验组光镜下肝脏病理学变化(×100)

图2　对照组光镜下肝脏病理学变化(×100)

2.5针刺干预后小鼠血清瘦素水平的变化

成年 Y123F小鼠表现为血清高瘦素现象(hyper leptinemia),针刺干预后,Y123F小鼠的血清瘦素水平明显降低,经统计学分析,两组小鼠的血清瘦素水平有统计学差异(P＜0.05)。详见表4。

表4　各组干预后小鼠血清瘦素水平的变化(±s,ng/mL)

表4　各组干预后小鼠血清瘦素水平的变化(±s,ng/mL)

注:与对照组比较1)P＜0.05;与野生型比较2)P＜0.001

组别　n　　瘦素实验组　6　30.33±11.931)2)对照组　5　54.40±2.70野生型　4　0.19±0.08

3　讨论

肥胖病也称肥胖症,是指人体摄食过多,而消耗能量的体力活动减少,使摄入的能量超过消耗的能量,过多的热量在体内转变为脂肪大量蓄积起来,使脂肪组织的量异常增加,超过标准体重20%者,称为肥胖[12]。据我国2004年10月卫生部、科技部、国家统计局发布的《中国居民营养与健康现状》[13]显示,我国成人超重率为22.8%,肥胖率为7.1%,估计人数分为2.0亿和6000多万。1994年Zhang Y等[14]在小鼠中成功克隆了肥胖相关基因瘦素(OB),瘦素通过瘦素受体(Ob-R)介导信号转导,在糖脂代谢与能量代谢平衡中起着非常重要的调节作用。Ob-Rb是小鼠瘦素受体5种亚型中的一种,其胞内端有3个重要的酪氨酸位点985、1077、1138,这3个酪氨酸位点的磷酸化在胞内瘦素信号转导中起着非常重要的作用[15-16]。Y123F小鼠是采用基因敲入技术,将Ob-Rb的985、1077和1138位的3个酪氨酸(Y)都突变为苯丙氨酸(F),导致该小鼠下丘脑中的STAT3等酪氨酸依赖型信号传导通路不能被激活,呈现出高瘦素现象,另外,Y123F小鼠还表现为一定程度的食欲亢盛,表现为成年后肥胖,血糖和血脂高。但与瘦素受体 Ob-Rb完全缺失的 db/db小鼠[17]相比,Y123F小鼠的肥胖程度和代谢紊乱程度较低,此外,Y123F小鼠与db/db小鼠一样,都表现为雄性不育。因Y123F肥胖小鼠模型更接近人类的病理特征,所以是研究遗传性肥胖的理想对象。

中医学认为肥胖症乃过食肥甘厚味,久坐少动,脾失健运,水湿停滞,聚湿成痰,痰湿流溢肌肤所致,其本质是本虚标实,以气虚阳虚为本,以多痰多湿为标。针灸作为中医学的传统治疗手法,对于肥胖的治疗已取得相当有效的进展,已有实验[18]证明针灸减肥具有疗效显著、安全简单、无毒副反应的优点。现代研究表明针灸减肥的机制主要有神经系统的调节作用、胃肠调理功能、改善新陈代谢及改善内分泌系统功能4个方面。中脘为胃之募穴,八会穴之一,腑会穴,是脾胃生化输布的枢纽、营卫气血之源,且痰湿生于脾,腑以通为顺,故刺中脘,可使三焦气化,散布精微于五脏六腑,行气化痰湿[19-21]。实验研究[22]亦证实针刺中脘对胃肠功能有调整作用。足三里属足阳明胃经合穴,具有健脾和胃、利湿化痰的作用,针刺足三里可以起到抑制饥饿中枢、降低食欲、加快胃肠道蠕动的作用,改善肥胖状态[23-24]。

本次实验结果证明,针刺小鼠中脘及双侧后三里能够有效地降低Y123F小鼠的体重、饮食量和血糖水平,针刺干预后实验组小鼠与对照组小鼠相比,血糖差异有统计学意义。但针刺干预后,总胆固醇(TC)含量、甘油三酯(TG)含量、低/高密度脂蛋白(LDL-C/HDL-C)含量,与对照组比较差异无统计学意义。此外,针刺干预后,能显著降低Y123F小鼠的血清高瘦素水平,并改善肝脏细胞质量。

[1]Albu-Shamah A,Zhan J.Towards obesity causes,prevalence and prevention[C].International Conference on Social Computing(Social Com),2013:852-857.

[2]杨媛,刘云霞.针灸治疗肥胖型2型糖尿病临床研究进展[J].现代中医临床,2014,21(3):53-56.

[3]李海峰,闫爵.近年来针灸治疗肥胖症的研究现状[J].药物与人, 2014,27(6):303-304.

[4]汪艳霞.单纯肥胖的针灸处理效果探析[J].鄂州大学学报,2014, 21(5):106-108.

[5]谭金凤,赵晖,许婧.近5年针灸减肥研究进展[J].湖南中医杂志, 2014,(3):174-176.

[6]张勇,赵强.国内针灸治疗肥胖症实验研究进展[J].天津中医药大学学报,2014,33(2):125-127.

[7]刘运珠,粟胜勇,潘秋兰,等.针灸治疗改善肥胖症内分泌代谢异常的机制与临床研究[J].光明中医,2014,(9):2009-2010.

[8]杜宏银,张玉彬.针灸治疗肥胖的作用与分子机制[J].上海针灸杂志,2013,32(8):691-694.

[9]张宝霞.针灸配合药物治疗肥胖病及临床研究概况[J].亚太传统医药,2014,10(7):49-50.

[10]刘思,常乐,许婧.针刺减肥作用机制的研究进展[J].四川中医, 2014,32(2):175-177.

[11]Jiang L,You J,Yu X,et al.Tyrosine-dependent and-independent actions of leptin receptor in control of energy balance and glucose homeostasis[J].Proc Natl Acad Sci USA,2008,105(47):18619-18624.

[12]戴居云.肥胖病[M].上海:上海科学普及出版社,2004:1.

[13]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会,科技部,国家统计局.中国居民营养与健康现状[N/OL].北京:中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会,2004.ht tp://www.moh.gov.cn/wsb/pzcjd/ 200804/21290.shtml.

[14]Zhang Y,Proenca R,MaffeiM,etal.Positional cloning of themouse obese gene and its human homologue[J].Nature,1994,372(6505): 425-432.

[15]MyersMG Jr.Leptin receptor signaling and the regulation ofmammalian physiology[J].RecentProg Horm Res,2004,59:287-304.

[16]Bjørbaek C,Kahn BB.Leptin signaling in the centralnervoussystem and theperiphery[J].RecentProg Horm Res,2004,59:305-331.

[17]Hegyi K,Fülöp K,Kovács K,et al.Leptin-induced signal transduction pathways[J].Cell Biol Int,2004,28(3):159-169.

[18]张君,邵素菊,高希言.补脾泻胃针灸法治疗单纯性肥胖症的理论初探[J].中医学报,2013,28(3):448-449.

[19]原鸿雁.开穴针灸治疗肥胖病500例[J].陕西中医,2013,(6):743 -744.

[20]郭迪.针刺配合穴位埋线治疗单纯性肥胖[J].吉林中医药,2010, 30(5):420-421.

[21]李瑞,贾成文.腹针配合推拿治疗单纯性肥胖症32例[J].陕西中医,2009,(6):721.

[22]吴丹凌,周胜红.针灸治疗单纯性肥胖取穴规律的研究[J].针灸临床杂志,2013,29(1):53-57.

[23]尹超群,杨卫华.点按足三里治疗婴儿单纯性肥胖33例[J].光明中医,2013,28(12):2653-2654.

[24]唐庆芬,邓倩萍,徐秋玉.肥三针治疗单纯性肥胖50例疗效观察[J].新中医,2004,36(10):50-51.

Effectof Acupunctureon Glycolipid Metabolism and Leptin in Male Obese Y123FM ice

WAN Yu-qian1,CHEN Liang1,SHEN Wei-dong2.1.ShanghaiUniversity ofTraditional Chinese Medicine,Shanghai201203,China;2.ShanghaiUniversity ofTraditional ChineseMedicine Shuguang Hospital,Shanghai201203,China

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2016.02.0214

1005-0957(2016)02-0214-04

上海中医药大学杏林团队培养计划以及海外及港澳学者合作研究基金项目(81328005)

万钰茜(1989-),女,2012级硕士生

沈卫东(1967-),男,教授,Emai l:shenweidong1018@ hotmai l.com

2015-05-20