土壤微生物分离纯化和分子鉴定实验研究

吴秋芳，付　亮，路志芳（安阳工学院生物与食品工程学院，河南安阳455000）

土壤微生物分离纯化和分子鉴定实验研究

吴秋芳，付亮，路志芳
（安阳工学院生物与食品工程学院，河南安阳455000）

摘要：通过微生物学实验项目“微生物分离纯化和分子鉴定”的实施，在生物技术专业本科生中开展了土壤细菌的分离、纯化和鉴定实验。学生在老师的带领下从太行山采集了土壤样品，利用平板法进行了土壤中细菌、真菌和放线菌的分离、纯化，对分离纯化的细菌进行了16SrDNA序列分析，结果表明：该细菌为假单孢杆菌。学生通过野外采集土样，实验室分离纯化的实验过程，既锻炼了学生的实验动手能力，又培养了学生的学习兴趣，激发了学生的学习热情，加深了学生对微生物理论知识的理解，提高了学生的创新能力。

关键词：土壤细菌；分离纯化，分子鉴定；实验教学

D01：10.19329/j.cnki.1673-2928.2016.04.010

微生物学实验课是面向生物技术、生物科学、环境科学、食品、发酵和农林等专业的学生所开设的基础实验课，其教学目的是，通过微生物实验的开展，帮助学生理解课堂基础理论知识，掌握基本的实验方法，提高学生的综合能力的培养。通过长期的实验教学的积累，将“土壤微生物分离纯化鉴定”进行了凝练和总结，建立了综合性实验项目“土壤细菌分离纯化和分子鉴定”，通过对土壤样品处理中微生物纯化分离与培养实验的研究与探索，丰富了生物技术专业的微生物实验项目的教学内容，使学生掌握了微生物学的基本实验操作技能，了解了微生物学的基础理论知识，加深了学生对课堂理论基础知识的理解，培养了学生观察、思考和分析问题的能力，提高了学生解决问题的能力，激发了学生的勇于开拓创新的精神，达到了培养应用型人才的目的［1-3］。

1土壤细菌分离纯化实验

微生物实验主要包括环境微生物的检测和菌落识别、各类微生物的形态观察，生长繁殖的测定，菌种的分离、培养、鉴定和保藏等内容［4］。根据实验教学的特点，设计了微生物综合实验“土壤微生物分离纯化鉴定”实验，实验内容有若干实验组成，所有实验均为微生物基础性实验，学生在老师的指导下进行。

1.1实验准备工作

1.1.1土壤样品采集

样品采集时间为2015年6月1日，地点在太行山大峡谷（E113.514587，N35.640880，海拔：1251.20），装入事先准备好的无菌牛皮袋中，带回实验室［5］，放入4℃冰箱保存备用。

1.1.2土壤菌悬液的制备

称取鲜土样于盛有灭菌的无菌水的培养瓶（事先放好无菌的玻璃珠）中，室温下在摇床上充分振荡，然后逐级稀释成不同稀释度待用。

1.1.3培养基的配制

不同微生物的分离培养使用不同的培养基种类。1）细菌培养使用牛肉膏蛋白胨培养基，pH调为7；2）真菌培养使用PDA培养基，pH自然；3）放线菌培养使用高氏一号培养基，pH调为7。

1.1.4实验用品的包装

实验所用培养皿5个一捆用报纸包好用橡皮筋扎好，锥形瓶用封口膜封口用橡皮筋扎紧，不同规格的枪头装枪头盒中，待灭菌后使用。

1.1.5灭菌

将配制好的培养基和实验用品以及纯净水在121℃灭菌20min，之后放烘箱烘干待用。

1.2土壤微生物的分离纯化

将灭菌的培养基制成平板，待平板冷却后，将土壤菌悬液10-2、10-3涂平板后进行放线菌的形态观察培养，将土壤菌悬液10-4、10-5涂平板后进行真菌形态的观察培养，将土壤菌悬液10-6、10-7涂平板后进行细菌的形态观察培养，倒置于30℃恒温培养箱内，细菌培养48h，真菌和放线菌培养培养168h观察菌落长势，挑单菌落进行分离纯化3～4次，得到细菌纯种。

1.3土壤微生物的形态观察

在分离纯化的微生物菌株中，将分离纯化后的一株细菌进行形态特征的观察，记录单菌落的形态特征，并使用莱卡显微镜进行细菌形态的观察，作为鉴定菌株的依据。图1为分离纯化的一株细菌菌株在牛肉膏蛋白胨培养基平板上的菌落，图2为莱卡显微镜下该细菌菌株的形态特征。

图1：细菌菌落形态

图2：细菌细胞形态（莱卡显微镜下观察结果）

1.4土壤微生物的生理生化特征的观察

将上述分离纯化的细菌进行革兰氏染色、芽孢染色和荚膜染色，明胶反应。

图3为分离纯化的细菌的革兰氏染色反应结果。

图3：细菌革兰氏染色结果（莱卡显微镜下观察结果）

1.5细菌16S rDNA全序列的测定

将上述分离纯化的这株细菌进行16S rDNA全序列的测定。

1）DNA提取：基因组抽提盒（TAKARA）。

2）16SrDN扩增：以细菌通用引物 F27（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）和R14.2（5'-CGGYTACCTTGTTACGACTT-3'）（引物均由上海杰里生物技术有限公司合成）扩增细菌16SrDNA，扩增片断长度大约是1.5 kbPCR产物；

3）目的片段胶回收。胶回收试剂盒（TAKARA）；

4）连接到pMD19-T载体；

5）转化到大肠杆菌TJP10；PCR鉴定阳性转化子；

6）测序（上海杰里生物技术有限公司）。

1.6细菌16S rDNA序列分析结果

将分离纯化的一株细菌16S rDNA的全序列与NCBI数据库中参考数据进行比对，发现与假单胞菌基因序列相似性为99%，因此初步判断该细菌为假单胞杆菌。

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2土壤微生物分离纯化实验效果

2.1丰富的实验内容激发了学生的学习积极主动性

本项目的土壤微生物的分离纯化实验内容包括了野外土样的采集，细菌、真菌和放线菌的分离纯化、形态观察、生理特征的观察、菌落计数和分子鉴定等内容，实验内容丰富，开阔了学生的视野，增长了学生的见识。通常基础微生物实验教学内容主要以细菌为实验对象开展教学，学生因此对细菌的认识较深，而对于真菌和放线菌的认识更多地停留在概念上，印象较为模糊，通过本实验的实施，使学生对细菌、真菌和放线菌的认识进一步加深，了解不同微生物种类分离需要使用不同的培养基，而且培养基的PH还直接影响到微生物的分离效果，尤其是放线菌的分离对培养基的种类和PH要求更高。丰富的实验教学内容使学生进一步对微生物世界有了新的认识，微生物原来这么漂亮，种类这么多，其直观、鲜明的图案可勾起学生的强烈兴趣，促进了学生的学习热情，使枯燥的理论知识在学生心中升华，促进了学生把理论知识转化成实践知识的动力，奠定了科研型和应用型人才的培养基础［6-8］。

2.2野外土样采集开阔了学生的视野

学生在老师的带领下，到太行山大峡谷采集了野外土壤样品，土壤中有多种多样的微生物种类，其野外采集过程开阔了学生的视野，采集之前的准备环节和采集过程的操作，更使学生明白实验结果的获得与整个实验过程有着紧密的联系，实验过程的诸多细节对实验的结果有着重要的影响。

2.3实验方法的多样化培养了学生严谨的实验态度

土壤样品中微生物的种类多种多样，将不同微生物从土壤中分离出来，需要多个实验步骤，每个步骤都需要若干准备环节组成，为了获得不同的微生物菌株，选择了不同的培养基，甚至在培养基中加入了氯霉素等抗生素，来抑制不同杂菌的生长，就是这么严谨的实验操作，学生做出的平板中细菌中混有真菌，真菌中混有细菌。为了进一步纯化微生物菌株，学生做实验更加认真，对微生物进行了多次划线分离后终于得到了纯菌落，这个实验项目着实培养了学生严谨的实验态度，锻炼了学生的动手操作能力，培养了学生了创新的能力［9-11］。

2.4分子生物学知识激发了学生的求知欲

3结语

土壤微生物分离纯化与培养实验项目属于综合性实验，有多个实验组成，系统的把原本孤立的实验联系起来，包括了野外土壤样品的采集，实验仪器的使用、实验器皿的包装、实验试剂的配制等，每个实验环节都让学生参与，锻炼了学生的实验操作基本技能，提高了学生学习的积极主动性，丰富了实验教学内容，激发了学生的学习兴趣，培养了学生的创新思维，提升了实验教学水平，促进了我校微生物实验教学的发展。

参考文献：

［1］张娴，王士分，唐贤春，等.土壤放线菌分离纯化实验的研究［J］.实验室研究与探索，2012，31（5）：138-140，172.

［2］王云创，秦丹，刘俊杰，等.在实验教学中培养创造性思维能力［J］.实验室研究与探索，2010，29（5）：40-142.

［3］余小滢.创新人才培养与实践教学改革［J］.实验技术与管理，2010，27（5）：30-32.

［4］周德庆.微生物学实验教程［M］.第二版.北京：高等教育出版社，2006.

［5］黄秋华，鲁秀国，吴彩斌.开展“环境微生物学”课外实践小组的探索［J］.实验室研究与探索，2010，29（2）：99-102.

［6］解秋菊，张春云，闫培生.微生物学实验课教学改革与实践［J］.实验室科学，2009（1）：54-56.

［7］易力，汪洋，陈万光，等.推进微生物学实验教学改革，培养学生的综合能力［J］.实验室科学，2010，13（1）：10-11.

［8］夏曦中，彭方，车婧，等.创新型实验教学项目建设的探索：土壤微生物分离实验［J］.微生物学通报，2014，49（12）：2525-2529.

［9］黎志东，徐志凯.启发式等三种教学方法在医学微生物教学中的应用［J］.微生物学通报，2015（50）：218-222.

［10］王晓兰，关洪斌.把实验室建成培养学生动手能力和创新意识的摇篮［J］.实验室研究与探索，2007，26（8）：4-5，32.

［11］傅水根，卢达溶，汤斌.创建实验室科研探究课程，促进本科研究型教学改革［J］.中国大学教学，2008（3）：48-49.

［12］林亚南，林鹭，杜妮.发挥精品课程示范作用，提升教学质量［J］.中国大学教学，2009（10）：22-23.

［13］王金星，刘天模.通过实验教学提高学生创新能力的尝试［J］.实验室研究与探索，2011，30（7）：255-258.

［14］张红光，李雨竹，袁亚丽，等.加强实践教学内涵建设培养应用型创新人才［J］.实验室研究与探索，2010，30（8）：139-142.

（责任编辑：郝安林）

中图分类号：Q93-3

文献标志码：A

文章编号：1673-2928（2016）04-0027-03

收稿日期：2015-12-08

基金项目：安阳工学院校级基金项目（YJJ2015011）。

作者简介：吴秋芳（1974-）女，河南安阳人，副教授，在读博士，研究方向：环境微生物。

Purification and Molecular Identification Experiments of Microbe in Soil

WU Qiufang，Fu Liang，LU Zhifang
（School of Biological and Food Engineering，Anyang Institute of Technology，Anyang，455000，China）

Abstract:With the progress of the microbe experimental project，"purification and molecular identification experiments of microbe"，the purification and molecular identification experiments of bacteria in soil were conducted by biotechnology majors.The students went to Taihang Mountains to collect soil samples and isolated the bacteria，fungi and actinomycetes from the soil and purified the bacteria by using pour plate method and streak plate method.The purified strain was preliminarily identified as Pseudomonas according to the analysis of its 16s rDNA sequence.Students through the field to collect soil samples，the separation，purification of lab experiment process and their practical ability was cultivated and their develop the students'interest in learning enthusiasm in leaming was stimulated.In addition，not only was students'understanding of the basic theoretical knowledge of micrology enhanced but also their creative adility were promoted.

Key words:in soin；isolation and purification；molecular identification；experiment