蓖麻标雌/单雌/两性系花序MSAP反应体系的建立

赵 永，朱国立，何智彪，包春光，4，陈晓凤，姜桐桐，李佳会，黄凤兰，3，5，周婷婷，常旭丰，刘佳琪

（1.内蒙古民族大学生命科学学院，内蒙古通辽 028000；2.通辽市农业科学研究院，内蒙古通辽 028000；

3.内蒙古高校蓖麻产业工程技术研究中心，内蒙古通辽 028000；4.通辽市农畜产品质量安全中心，内蒙古通辽 028000；5.内蒙古蓖麻育种重点实验室，内蒙古通辽 028000）

蓖麻标雌/单雌/两性系花序MSAP反应体系的建立

赵 永1，朱国立2，3，5，何智彪2，包春光1，4，陈晓凤1，姜桐桐1，李佳会1，黄凤兰1，3，5，周婷婷1，常旭丰1，刘佳琪1

（1.内蒙古民族大学生命科学学院，内蒙古通辽 028000；2.通辽市农业科学研究院，内蒙古通辽 028000；

3.内蒙古高校蓖麻产业工程技术研究中心，内蒙古通辽 028000；4.通辽市农畜产品质量安全中心，内蒙古通辽 028000；5.内蒙古蓖麻育种重点实验室，内蒙古通辽 028000）

为了建立Lm型雌性系蓖麻不同发育时期的标雌/单雌/两性系花序MSAP反应体系，提取不同类型不同发育时期的花序基因组DNA，混合成基因池；用Eco RⅠ和HpaⅡ/MspⅠ的组合，12 h可将DNA酶切完全；16℃条件下，将酶切产物与Eco RⅠ、HpaⅡ/MspⅠ接头过夜连接；连接产物用于预扩增。优化后的预扩增反应体系为10×PCR Buffer 2.5μL、dNTPs（10 mmol/L）2.5μL、Mg2+（25 mmol/L）2.0μL、模板2.0μL、E0扩增引物（10 pmol/μL）1.5μL、H0扩增引物（10 pmol/μL）1.5μL、LA Taq（5 U/μL）0.25μL、ddH2O 12.75μL。预扩增产物稀释10倍后用于选择性扩增。优化后的选择性扩增体系为10×PCR Buffer 2.5μL、dNTPs（10 mmol/L）2.0μL、Mg2+（25 mmol/L）4.0μL、模板3.0μL、EX扩增引物（10 pmol/μL）1.0μL、H/MX扩增引物（10 pmol/μL）1.0μL、LA Taq（5 U/μL）0.30μL、ddH2O 11.2μL。

蓖麻；花序；MSAP

蓖麻（Ricinus communis L.）是重要的工业油料作物之一［1-2］。蓖麻油是唯一可以替代石油在生产生活中广泛应用的植物油［3-6］。中国是蓖麻第二大生产国。现阶段中国蓖麻产业发展面临一个极其突出的矛盾，即种子供不应求但收购价格偏低。提高蓖麻单产水平，是解决这一矛盾的有效措施之一。因此，高产仍然是蓖麻育种的首要目标。但是，蓖麻育种还未实现三系配套［7］，主要育种方法有“拟三系配套”和 “一系两用”“两系法”，后者使我国蓖麻杂优利用的大面积制种技术问题基本得到解决，目前通辽市农业科学研究院主要采用这种育种方法，Lm型雌性系是该方法育种的基础材料。Lm型雌性系蓖麻同时包含标雌、单雌和两性系3种花序类型。国内虽有对蓖麻花序特征及花芽分化的研究，但是对标雌、单雌和两性系花序发育的基因水平差异研究尚未见报道。

DNA甲基化可以称作是细胞记忆的一种机制，5′胞嘧啶甲基化是真核生物DNA甲基化的主要形式［8］，这种DNA修饰方式并没有改变基因序列，由于甲基化的DNA不容易被转录，因此DNA甲基化被认为在发育的时序上限制获得可转录基因［9］。甲基化能引起生物染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达［10-13］。DNA甲基化参与抗逆基因表达调控［14］。其中，MSAP（DNA甲基化敏感扩增多态性）由于其简便性与通用性成为DNA甲基化水平较为常用的检测方法［15］。由于DNA甲基化是基因组DNA在转录水平上进行调控的一种自然修饰方式，在高等植物中广泛存在，所以MSAP技术被逐渐应用于植物的DNA甲基化检测［16-17］。

因此，本试验的目的是以Lm型雌性系蓖麻在营养生长期（4片真叶期）、营养生长到生殖生长转变期（5片真叶期）、主茎穗开花期、二级分枝开花期的标雌、单雌、两性系花序为研究对象［18］，建立其MSAP反应体系，为确定不同类型不同发育时期的花序差异表达基因研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

植物材料：Lm型雌性系蓖麻aLmAB2在营养生长期（4片真叶期）、营养生长到生殖生长转变期（5片真叶期）、主茎穗开花期、二级分枝开花期的标雌、单雌、两性系花序，共12个样品，由通辽市农业科学研究院蓖麻研究室提供。

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA的提取及测定 提取12个花序样品的基因组DNA。提取过程参照庄盟生物植物基因组DNA小量提取试剂盒说明，并用核酸分析仪分别测定260，280 nm时的吸光度。

1.2.2 DNA的双酶切及与接头连接 将12个样品的基因组DNA按等浓度混合成基因池。以低频限制性内切酶Eco RⅠ和一组同裂酶HpaⅡ/MspⅠ对基因组DNA进行双酶切，酶切体系如下：DNA 10μL，Cut SmartTMBuffer 3μL，10×Eco RⅠBuffer 3μL，Eco RⅠ1μL，HpaⅡ/MspⅠ1μL，ddH2O 12μL。将酶切混合物置于37℃水浴锅中12 h，酶切结束后65℃5 min灭活。琼脂糖电泳检测后，-40℃冰箱中冻存。

将酶切产物稀释2倍后与Eco RⅠ接头和HpaⅡ/ MspⅠ接头进行连接。将连接体系混合后16℃连接12 h。连接体系如下：DNA酶切产物30μL，Eco RⅠ接头1μL，HpaⅡ/MspⅠ接头1μL，10×T4Ligase Buffer 1μL，T4Ligase 1μL，ddH2O 30μL。

1.2.3 预扩增 25μL反应体系中分别加入10× PCR Buffer 2.5μL、dNTPs（10 mmol/L）、Mg2+（25 mmol/L）、模板、引物（10 pmol/μL）、Taq（5 U/m L），连接产物作为反应体系模板稀释5，10，15，20，25倍后进行PCR预扩增，预扩增引物E0：5′-GACTGCG TACCAATTC-3′；H/M0：5′-ATCATGAGTCCTGCTCG G-3。反应体系的设置见表1。反应程序：94℃4 m in；94℃30 s，56℃1 m in，72℃1 m in，30个循环；72℃6 m in；16℃保存。扩增产物用1%的琼脂糖电泳检测。

1.2.4 选择性扩增 选择性扩增引物序列见表2。25μL反应体系中分别加入10×PCR Buffer 2.5μL、dNTPs（10 mmol/L）、Mg2+（25 mmol/L）、模板、引物（10 pmol/μL）、Taq（5 U/m L），预扩增产物作为选择性扩增反应的模板稀释3，5，10，20倍后作为选扩的模板。选择性扩增的反应体系见表3，反应条件为94℃150 s；94℃1 min，65℃45 s，72℃1 min，共13个循环；退火温度每个循环下降0.7℃；94℃1 min，56℃45 s，72℃1 min，共23个循环；72℃6 m in；16℃保存。经6%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测选择性扩增产物，100 V预电泳30 min，再700 V电泳4 h电泳后银染观察。

表1 预扩增反应体系各组分的加入量Tab.1 Pre-am p lification system added am ount of each com ponent μL

表2 选择性扩增引物Tab.2 Selective am p lification p rim er

表3 选择性扩增反应体系各组分的加入量Tab.3 Selectiveamplificationsystemaddedamountofeachcomponent μL

2 结果与分析

2.1 基因组DNA提取结果

12个样品的基因组DNA提取琼脂糖凝胶电泳检测结果见图1。取出1μLDNA样品稀释100倍后，用紫外分光光度计测OD260、OD280值，并计算OD260/280比值。12个样品的OD260/280比值均为1.6～ 1.8，说明蛋白质和小分子物质污染较小，且提取的DNA亮度大完整性好，符合PCR的要求。

图1 基因组DNA提取结果Fig.1 GenomicDNAextractionresults

2.2 DNA双酶切及连接结果

DNA的双酶切及与接头连接结果见图2。通过图2得知100～1000bp呈涂抹带，说明DNA被完全切开，符合MSAP的技术要求。

图2 DNA双酶切及连接结果Fig.2 DNAdoubledigestionandjoinresult

2.3 预扩增结果

连接产物稀释不同倍数后进行预扩增的结果见图3。结果表明，连接产物稀释10倍后预扩增产物条带亮度大，且条带为100～1500bp，能够满足MSAP的技术要求。连接产物稀释10倍后，对预扩增反应体系进行优化，结果见图4。结果表明，最佳反应体系为10×PCR Buffer 2.5μL、dNTPs（10 mmol/L）2.5μL、Mg2+（25 mmol/L）2.0μL、模板2.0μL、E0扩增引物（10 pmol/μL）1.5μL、H0扩增引物（10 pmol/μL）1.5μL、LA Taq（5 U/μL）0.25μL、ddH2O 12.75μL。

图3 DNA预扩增结果Fig.3 DNA p re-am p lification resu lts

图4 预扩增体系优化结果Fig.4 Pre-am p lification system optim ization resu lts

2.4 选择性扩增结果

预扩增产物稀释不同倍数进行选择性扩增结果见图5。结果表明，预扩增产物稀释10倍后条带亮度大，能够满足MSAP的技术要求。预扩增产物稀释10倍后，对选择性扩增反应体系进行优化结果见图6，结果表明，最佳反应体系为10×PCR Buffer 2.5 μL、dNTPs（10 mmol/L）2.0μL、Mg2+（25 mmol/L）4.0μL、模板3.0μL、EX扩增引物（10 pmol/μL）1.0μL、H/MX扩增引物（10 pmol/μL）1.0μL、LA Taq（5 U/μL）0.30μL、ddH2O 11.2μL。12个样品的选扩结果见图7，结果表明条带明亮且清晰，符合后续试验的要求。

图5 选择性扩增结果Fig.5 Selective am p lification result

图6 选择性扩增体系优化结果Fig.6 Optim ization result of selective am p lification

3 结论与讨论

3.1 结论

蓖麻是一种重要的油料作物，花序是与其产量直接相关的性状。本试验以Lm型雌性系蓖麻aLmAB2在营养生长期（4片真叶期）、营养生长到生殖生长转变期（5片真叶期）、主茎穗开花期、二级分枝开花期的标雌、单雌、两性系花序，共12个样品建立其MSAP反应体系。提取不同类型不同发育时期的花序基因组DNA，混合成基因池；用EcoRⅠ和HpaⅡ/MspⅠ的组合，12 h可将DNA酶切完全；16℃条件下，将酶切产物与EcoRⅠ、HpaⅡ/MspⅠ接头过夜连接；连接产物用于预扩增。优化后的预扩增反应体系为10×PCR Buffer 2.5μL、dNTPs（10 mmol/L）2.5μL、Mg2+（25 mmol/L）2.0μL、模板2.0μL、E0扩增引物（10 pmol/μL）1.5μL、H0扩增引物（10 pmol/μL）1.5μL、LA Taq（5 U/μL）0.25 μL、ddH2O 12.75μL。预扩增产物稀释10倍后用于选择性扩增。优化后的选择性扩增体系为10× PCR Buffer 2.5μL、dNTPs（10 mmol/L）2.0μL、Mg2+（25 mmol/L）4.0μL、模板3.0μL、EX扩增引物（10 pmol/μL）1.0μL、H/MX扩增引物（10 pmol/μL）1.0μL、LA Taq（5 U/μL）0.30μL、ddH2O 11.2μL。为确定不同类型不同发育时期的花序差异表达基因研究奠定基础。

图7 12个样品选择性扩增结果Fig.7 12 sam p les op tim ization resu lt of selective am p lification

3.2 讨论

3.2.1 酶切对扩增效果的影响 本试验的双酶切组合是Eco RⅠ和HpaⅡ/MspⅠ，对DNA的酶切时间进行优化，最终确定12 h酶切完全，能够最大限度地使整个基因池里的DNA得到充分的酶切，并且酶切片段为100～1 000 bp呈弥散状态，能够满足后续试验的要求。在试验过程中酶切不充分，PCR过程中就会丢失遗传信息，不利于分析差异表达基因。3.2.2 PCR反应体系对扩增效果的影响 PCR预扩增的结果直接影响选择性扩增的结果，因此，预扩增在本试验中至关重要［19］。连接产物作为预扩增的模板，浓度过高会增加非特异性条带的数目，浓度过低会影响预扩增产物的浓度，当连接产物稀释10倍时，条带分布在100～1 000 bp能够满足后续试验的要求。成功建立蓖麻预扩增反应体系。PCR的选择性扩增影响对差异条带的获得。Mg2+浓度的增加会增加Taq酶的活性从而增加特异性条带，但当Mg2+浓度过高时会抑制Taq酶的活性，从而使特异性条带的数量降低［20］。反应体系中加入的Mg2+（25 mmol/L）是4.0μL时，酶的活性达到最高。

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Estab lish Castor M arked Fem ale Lm Per Fem ale Am photeric Linein flores Cence M SAP Reaction System

ZHAO Yong1，ZHU Guoli2，3，5，HE Zhibiao2，BAO Chunguang1，4，CHEN Xiaofeng1，
JIANG Tongtong1，LI Jiahui1，HUANG Fenglan1，3，5，ZHOU Tingting1，CHANG Xufeng1，LIU Jiaqi1
（1.College of Life Science，Inner Mongolia University for Nationalities，Tongliao 028000，China；2.Tongliao Academy of Agricultural Science，Tongliao 028000，China；3.Inner Mongolia Region Industrial Engineering Research Center of Universities for Castor，Tongliao 028000，China；4.Tongliao Quality and Safety of Agricultural and Livestock Center，Tongliao 028000，China；5.Inner Mongolia Autonomous Key Laboratory of Castorbreeding，Tongliao 028000，China）

The purpose of this experiment was to establish Lm-type female system castor different developmental stagesmarked female，per female，amphoteric system inforescence establish MSAP reaction system.MSAP reaction system established to determine differences in inflorescence type genes at different developmental stages of research to lay the foundation.The results were as follows：extraction of different types at different developmental stages of inflorescence genom ic DNA m ixed into the gene pool.Eco RⅠand HpaⅡ/MspⅠdigested gene pool 12 h. The digestion products and Eco RⅠ，HpaⅡ/MspⅠadapter overnight connection for pre-amplification.The opti-mized system for the pre-amplification reaction 10×PCR Buffer 2.5μL，dNTPs（10 mmol/L）2.5μL，Mg2+（25 mmol/L）2.0μL，template 2.0μL，E0amplification primer（10 pmol/μL）1.5μL，H0amplification primer（10 pmol/μL）1.5μL，LA Taq（5 U/μL）0.25μL，ddH2O 12.75μL.Pre-amplification products were diluted 10-fold for the selective amp lification.Selective amp lification system optim ized for 10×PCR Buffer 2.5μL，dNTPs（10 mmol/L）2.0μL，Mg2+（25 mmol/L）4.0μL，template 3.0μL，EXamplification primer（10 pmol/μL）1.0μL，H/Mxamplification primer（10 pmol/μL）1.0μL，LA Taq（5 U/μL）0.30μL，ddH2O 11.2μL.

Castor；Inflorescence；MSAP

S563.03 文献标识码：A 文章编号：1000-7091（2016）03-0114-07

10.7668/hbnxb.2016.03.017

2016-01-12

国家自然科学基金项目（30760123；31160290；31460353）；国家农业部公益性行业专项（201003057）；内蒙古自治区高等学校“青年科技英才支持计划”（NJYT-14-A10）；内蒙古自治区科技创新引导项目；内蒙古自治区“草原英才”计划项目；市校合作项目（SXZD2012018；SXZD2012017；SXZD2012006）；内蒙古自治区高校蓖麻产业工程技术研究中心开放基金项目（BMYJ2011009）

赵 永（1990-），男，内蒙古赤峰人，在读硕士，主要从事蓖麻分子育种研究。

黄凤兰（1973-），女，山东菏泽人，教授，博士，主要从事蓖麻分子育种研究。