苹果MdSBP20基因抗非生物胁迫的研究

沙 婷，侯鸿敏，孟祥娜，柏素花，周爱琴，沙广利，戴洪义，祝 军

（1.青岛农业大学园艺学院，山东青岛 266109；2.青岛市农业科学研究院，山东青岛 266100）

苹果MdSBP20基因抗非生物胁迫的研究

沙 婷1，侯鸿敏1，孟祥娜1，柏素花1，周爱琴1，沙广利2，戴洪义1，祝 军1

（1.青岛农业大学园艺学院，山东青岛 266109；2.青岛市农业科学研究院，山东青岛 266100）

为获得苹果砧木逆境胁迫相关转录因子，以QZ1（平邑甜茶（Malus hupehensis Rehd.）×柱型苹果株系CO（Malus domestica Borkh.）和M26为试材，利用同源克隆法克隆得到苹果SBP基因cDNA的全长序列，命名为MdSBP20。对扩增得到的cDNA序列进行生物信息学分析，结果表明，该序列全长1 362 bp，包含完整开放阅读框1 362 bp，编码454个氨基酸，具有明显的SBP结构域，包含2个锌指结构Zn-1、Zn-2和双向核定位信号区NLS。系统进化树分析，结果表明MdSBP20与白梨（XM_009339726.1）和苹果（XM_008376435.1）亲缘关系较近。实时荧光定量分析结果表明，MdSBP20基因在低温、干旱、盐害中发挥一定功能，推测QZ1的耐寒性、耐旱性及耐盐性均强于M 26。研究表明，MdSBP20基因在苹果响应非生物逆境胁迫中具有重要调控作用。

苹果；非生物胁迫；MdSBP20基因；基因克隆；表达分析

苹果（Malus domestica Borkh.）是我国栽培面积和产量较大的重要果树，苹果树在整个生长发育过程中，经常遭遇各种不利环境的影响，如寒害、干旱、盐害、洪涝、矿物质缺乏等非生物胁迫因素，致使其减产，甚至死亡，从而造成经济损失。长期以来，人们主要通过传统的杂交育种手段来保持并改良苹果抗性性状，但苹果生长周期长、遗传杂合程度高、自交不亲和等特点给育种工作带来许多困难。近年来果树转基因技术的发展，特别是苹果全基因组测序的成功为加快苹果抗性育种进程提供了新的可能。

已有相关报道表明，在植物体遭受到低温、干旱、高盐等逆境胁迫时，转录因子可以调控相关基因的表达，在抗逆应答中发挥重要作用［1］。许多植物中的WRKY、bZip和MYB等转录因子都能够响应干旱、盐碱、低温等逆境胁迫，提高植物对非生物胁迫的耐受力［2-4］。SBP基因（Squamosa promoter binding protein，SBP）是绿色植物特有的一类转录因子，最早从金鱼草（Antirrhinum majus）中分离得到，因其能够识别并调控花发育基因的Squamosa启动子结合蛋白，故命名为SBP基因［5］。该基因有很多重要的生物学功能，已陆续从拟南芥［6］、白桦树［7］、衣藻［8］、苔藓［9］、番茄［10］、水稻［11］和苹果［1］中分离。在前期对该基因的研究主要集中在花发育方面，但最近有研究表明，SBP-box基因可以通过参与防御反应的基因相互作用对各类生物和非生物胁迫做出响应［12］。伏马毒素B1（Fumonisin B1）是一种可以诱导植物细胞程序性死亡的真菌类毒素。研究发现AtSPL14基因参与了该细胞程序性死亡，且在伏马毒素B1的敏感性方面有重要作用［13］。AtSPL7可以通过miR397、miR408和mir857来下调相关铜蛋白的表达水平。在铜缺乏条件下，AtSPL7还可以通过铜离子重新分配来弥补铜素缺乏进而调节植物体内的铜平衡［14］。此外，衣藻中的SBP基因Cu response regulatorⅠ（CrrⅠ）也有类似的作用［8］。SBP基因是m ir156的靶基因，而m icRNA可以通过调节靶蛋白编码基因的表达来实现其在植物中的各种生物学功能。许多不同物种中的研究表明，miR156对高温［15］、低温［16-17］、盐［18-20］、干旱［19-20］、紫外辐射［21］、低氧［18］等非生物胁迫均有响应。

本试验克隆了抗逆相关基因MdSBP20，并研究在各种非生物胁迫下，不同砧木中该基因的表达模式，旨在初步探索MdSBP20基因在苹果抗非生物胁迫方面的功能，为进一步深入研究SBP家族基因在苹果抗逆反应过程中的机理提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试材选用的QZ1和M26组培苗由青岛市农业科学研究院提供。分别将在MS+0.5 mg/L 6-BA+ 0.2 mg/L NAA+0.1 mg/L GA3（MNG）中培养20 d的QZ1和M26健康植株转接至MNG培养基、MNG+低温（4℃）处理、MNG+400 mm/L甘露醇、MNG+ 150 mm/L NaCl的培养基中，模拟干旱和盐碱处理。分别于处理3，6，12，24，48，96，120，168 h时取其全株，对照为处理3 h的样品，液氮速冻后置于-80℃冰箱保存，用于植物总RNA的提取。本试验于青岛农业大学园艺学院完成。

1.2 试验方法

1.2.1 总RNA的提取及反转录 采用EASYspin植物RNA快速提取试剂盒（原平晧生物技术有限公司）提取QZ1、M26植株的总RNA。并用紫外分光光度计法（NanoDrop）和琼脂糖凝胶电泳法（1.0%）检测所提取RNA的纯度、浓度和完整性。采用TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）试剂盒反转录。

1.2.2 苹果MdSBP20基因cDNA全长的克隆 参照苹果全基因组数据库［22］及前人的研究结果［1］，选用Premier5.0设计特异引物MdSBP20-F和MdSBP20-R（表1）。以2种苹果砧木cDNA第一链为模板扩增MdSBP20基因cDNA全长，其反应体系20μL，其中cDNA模板1.0μL，Dream TaqTMGreen PCR Master Mix（2×）10.0μL、上下游引物MdSBP20-F和MdSBP20-R各0.8μL、ddH2O 7.4 μL。扩增的反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸2 min，30个循环；72℃延伸10 m in。凝胶电泳检测并回收目的片段（北京天根生物工程有限公司的胶回收试剂盒），先连接到pGEM-Teasy载体（Promega Madison.W I. USA）后转化DH5α。经蓝白斑筛选，PCR鉴定后送交生工生物工程（上海）技术服务有限公司测序，使用软件DNAMAN检验其测序准确性。

1.2.3 苹果MdSBP20基因序列的生物信息学分析应用DNAMAN6.0进行MdSBP20 cDNA全长序列拼接，利用美国国立生物技术信息中心（http：// www.ncbi.nlm.nih.gov/）网站进行该基因ORF（Open reading frame）的确定、保守结构域的分析，检索近缘物种的SBP序列信息；通过MEGA软件进行系统进化树和蛋白多重序列比对分析；使用Prot-Param tool（http：//web.expasy.org/proteom ics/）对蛋白质的理化性质进行分析（包括氨基酸组成、分子量、等电点等）。

表1 苹果M dSBP20基因的克隆及表达分析所用的引物Tab.1 Prim ers used to isolate and analyze the exp ression of M dSBP20 in M alus

图1 M dSBP20基因的PCR扩增结果Fig.1 Agarose gel electrophoresis analysis of M dSBP20 gene fragm en ts

图2 M dSBP20的全长cDNA序列以及推导的氨基酸序列Fig.2 The full-length cDNA sequence of M dSBP20 and its am ino acid sequence

1.2.4 MdSBP20的RT-PCR分析 利用实时荧光定量PCR技术分析苹果MdSBP20基因的表达量。用PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real Time（TaKaRa）试剂盒将继代培养20 d健康的QZ1、M26植株（6，12，24，48，96，120，168 h）各个时间点儿的总RNA反转录合成cDNA备用。根据实时荧光定量PCR引物设计的原则分别设计内参引物Actin RT-F、Actin RT-R及特异引物MdSBP20RT-F和MdSBP20RT-R（表1）。试验参照SYBR Premix ExTaqTMⅡ（Perfect Real Time）（TaKaRa）试剂盒的说明书在Roche LightCycler 480Ⅱ实时定量PCR仪上完成。按照TaKaRa生物公司的SYBR-Green试剂盒说明书进行操作，配置20μL反应体系：SYBR prem ix 10μL，cDNA 1.0μL（取1μg RNA合成第1链cDNA，然后将cDNA模板稀释5倍），上下游引物（10.0μmol/L）各0.8μL，Sterile Water 7.4μL。扩增程序如下：95℃预变性10 min；95℃10 s，60℃30 s，72℃10 s延伸，进行45个循环。在此过程中连续检测其荧光值绘制溶解曲线；采用2-ΔΔCT方法［23］分析数据；利用Excel进行绘图，并使用SPSS进行单因素方差分析及Duncan检测；每个时间点进行3次生物学重复和3次技术重复。

2 结果与分析

2.1 MdSBP20基因cDNA的全长序列克隆和序列分析

以QZ1、M26植株基因组cDNA为模板，选用特异引物MdSBP20-F和MdSBP20-R作为上下游引物进行PCR扩增，得到与MdSBP20目的片段大小一致的约1 300 bp的条带（图1）。经切胶回收后与pGEM-Teasy载体连接转化DH5α并进行测序。结果表明，2条cDNA片段大小均为1 362 bp，与基因组DNA序列完全一致。Blast比对分析表明，结果与根据苹果全基因组数据库预测的序列结果吻合，因此，确认获得正确的核苷酸序列。使用NCBI搜索MdSBP20的ORF，最大为1 362 bp，编码454个氨基酸，预测其蛋白质分子量为49.372 32 kDa，等电点为8.597，且分析表明，SBP基因含有一个完整的SBP-domain结构域（PF03110），经序列比对分析发现这2个基因与苹果基因组数据库中苹果金冠的基因序列一致（图2）。

2.2 M dSBP20基因的同源性及进化分析

以MdSBP20基因序列为模板，通过NCBI Blast获得与其序列相似度较高的其他物种SBP基因序列并进行进化树和多重比较分析。进化树分析结果表明，该基因与白梨PbSBP6、苹果MdSBP6、番茄SlySBP6a、SlySBP6c亲缘关系较近，其中与白梨的遗传距离最近（图3）。对搜索获得的所有SBP基因结构域多重比较分析发现，MdSBP20基因与其他已知基因序列类似，也含有一个完整的SBP-domain结构域（PF03110），其中包含2个锌指蛋白结构Zn-1、Zn-2和一个双向核定位信号区NLS（Nuclear location signal）；第2个锌指结构与核定位信号是部分重叠的，第1个锌指结构的类型是CysCysHisCys，第2个锌指结构的类型是CysCysCysHis（图4），表明MdSBP20是苹果SBP家族基因中的一员且SBP结构域在植物进化过程中保守程度较高。

图3 M dSBP与其他植物的系统进化树分析Fig.3 Phy logenetic tree of M dSBP and the other p lan ts

2.3 M dSBP20基因非生物胁迫的表达分析

2.3.1 低温胁迫中的表达 本试验分析了QZ1、M26在低温胁迫4℃处理后MdSBP20基因的表达特性（图5）。结果表明：低温胁迫处理QZ1、M26在各个时间点均能检测到MdSBP20基因的表达，但两者在表达模式上存在一定差异（图5），QZ1中，伴随低温胁迫时间不断延长，MdSBP20基因的表达量呈稳定上升趋势，120 h表达量达到最高，是对照0 h的13倍（图5-A）；M26中，MdSBP20基因在短期冷胁迫中被迅速激活，处理6 h时表达量达到峰值，是对照0 h的5.4倍，随后开始降低，48 h表达量达到最低。随着胁迫时间的延长，该基因的表达量在96 h时达到第2个峰值（图5-B）。总的来说，低温胁迫处理后，MdSBP20基因在QZ1中表达增加倍数要明显高于M26，表明QZ1的抗低温（4℃）的能力可能要比M26强。

2.3.2 干旱胁迫中的表达 本试验分析了QZ1、M26中MdSBP20基因在对干旱胁迫的响应（图6），分析结果如下：MdSBP20基因在QZ1中有较强的响应。12 h时表达被迅速激活，48 h时表达量达到最高，是对照0 h的4.1倍（图6-A），之后一直有较高水平的表达；而M26中表达量变化不明显（图6-B）。也初步说明MdSBP20基因参与了苹果砧木中的抗旱反应，且QZ1可能比M26的抗旱能力强。

图4 苹果M dSBP20基因和所选物种中SBP基因保守结构域分析Fig.4 Analysis of the SBP dom ain in M dSBP20 and the selected SBP gene from p lant species

图5 M dSBP20基因在QZ1和M 26低温胁迫处理不同时间点的表达Fig.5 Exp ression of M dSBP20 gene from QZ1 and M 26 after treatm en t of low tem perature

图6 M dSBP20基因在QZ1和M 26干旱胁迫处理不同时间点的表达Fig.6 Exp ression of M dSBP20 gene from QZ1 and M 26 after treatm ent of d rought stress

2.3.3 盐胁迫中的表达 本试验分析了MdSBP20基因对QZ1和M26盐胁迫的时空表达（图7）。结果表明MdSBP20基因在QZ1和M26中均上调表达。QZ1处理12 h时，该基因被迅速激活并达到峰值后，是对照的5.6倍。伴随胁迫时间延长，各时间点基因表达量降低但一直高于对照水平（图7-A）；M26中，MdSBP20基因在6，12 h出现短暂的下调表达后表达量开始逐渐升高并于96 h达到峰值，是对照0 h的3.4倍（图7-B）。说明MdSBP20基因可能参与了苹果砧木的抗盐碱反应，且QZ1比M26的抗盐碱能力强。

图7 M dSBP20基因在QZ1和M 26盐胁迫处理不同时间点的表达Fig.7 Expression of M dSBP20 gene from QZ1 and M 26 after treatm ent of salt stress

3 讨论

植物抗逆是指植物抵抗干旱、水涝、低温、高温、盐碱、病虫害等不良环境的能力。逆境包括物理、化学、生物因素等，可分为生物胁迫和非生物胁迫两大类。其中非生物胁迫中的干旱、低温、盐碱等因素是造成我国北方地区苹果大量减产和严重经济损失的重要原因。

已有相关报道指出，许多转录因子（WRKY、bZ-ip、MYB等）都能响应干旱、低温、盐碱胁迫，从而提高植物对非生物胁迫的耐受力［2-4］。SBP转录因子是近几年发现的一类植物特有的转录因子，在植物的整个生长发育阶段都起着重要的作用。本试验利用同源克隆法，克隆得到的MdSBP20，有典型的SBP保守结构域，包含2个锌离子结合位点（Cys-Cys-His-Cys和Cys-Cys-Cys-Hi）和保守的核定位信号（NLS），可以确定为SBP家族基因。目前关于SBP基因的功能研究主要集中在花发育领域，但随着研究的进一步深入，已有研究者指出这类转录因子在植物抗逆方面也有重要的功能。

相关报道指出，SBP基因是microRNA156（mir156）的靶基因，苹果基因组中也已鉴定了27个SBP家族基因，其中15个为mir156的靶基因［1］。本试验中，克隆得到的MdSBP20基因也包含mir156结合位点。试验研究表明mir156可以与SBP基因相互抑制，共同调节植物对高温［15］、低温［16-17］、盐碱［18-20］、干旱［19-20］、紫外辐射［21］、低氧［18］等非生物胁迫。在拟南芥遭受高温胁迫后，mir156基因上调表达［16］，同时m ir156对冷胁迫和紫外辐射胁迫亦有响应［21］。研究者对Osmir156k转基因水稻及野生水稻幼苗冷胁迫（4℃）研究发现，处理48 h后过表达Osmir156k的转基因植株变得萎蔫，叶片卷曲，停止生长甚至死亡，而野生型植株生长良好；恢复正常条件培养14 d后，83%野生型植株存活，转基因植株Osm ir156k-1和Osm ir156k-3幸存的分别只有40%和30%，且转基因水稻嫩枝和根系比野生型植株短小；进一步对其靶基因SPL3、SPL14和SPL17基因在冷胁迫处理后表达量的变化表明，在野生型基因中的表达量高于Osmir156k转基因植株，这些结果表明Osmir156k过量表达抑制了转基因植株中靶基因SPL的表达从而降低了转基因植株对冷胁迫的抗性［16］。本试验中苹果MdSBP20基因在QZ1和M26中经低温（4℃）处理后表达模式不同，在QZ1中，MdSBP20基因的表达量呈稳定上升趋势，120 h表达量达到最高，是对照0 h的13倍；在M26中，处理6 h时表达量达到峰值，是对照0 h的4.5倍，随后开始降低，48 h表达量达到最低。这个结果从另一方面说明QZ1对低温胁迫（4℃）的耐受力可能要比M26强。在烟草中过量表达水稻OsSPL1基因，随着盐浓度的增大，转基因烟草离体叶片中的叶绿素含量低于野生型烟草离体叶片中叶绿素的含量，降低了植物对盐胁迫的抗性［18］；低盐浓度处理陆地棉时，叶片中SPL2基因的表达量上调，随着盐浓度升高该基因表达量下降。PEG（Polyethylene p lycol）是亲水性大分子，具有很强的吸水性，可以使植物失水，造成干旱胁迫。在陆地棉叶片中，GhSPL2的表达量与PEG浓度有关，PEG浓度为2.5%时，该基因表现为下调，在低于或高于该浓度时，GhSPL2基因的表达量均被上调［20］。干旱胁迫16 d后，葡萄中VvSBP5、VvSBP6、VvSBP7和VvSBP17基因表达量受干旱胁迫影响均表现为上调表达［19］。在本试验中，MdSBP20基因在QZ1干旱处理后表达量也表现为显著上调，与前人研究结果类似。可以推测MdSBP20基因可能在苹果砧木抗非生物胁迫方面发挥一定的功能。

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Study on Abiotic Stress of M dSBP20 Gene from Malus

SHA Ting1，HOU Hongmin1，MENG Xiangna1，BAISuhua1，ZHOU Aiqin1，SHA Guangli2，DAIHongyi1，ZHU Jun1
（1.College of Horticulture，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China；2.Qingdao Academy of Agricultural Sciences，Qingdao 266100，China）

To obtain the transcription factor related to stress conditions in apple rootstock，an apple SBP gene with the full-length cDNA was cloned in Qingzhen 1（apomictic crabapple Pingyitiancha（Malus hupehensis Rehd.）× columnar apple strain CO（Malus×domestica Borkh.）and M26 via homology-based cloning method.The gene cloned was named as MdSBP20.Bioinformatics analysis to the cDNA showed that the full-length cDNA was 1 362 bp，it′s open reading frame possessed 1 362 bp，and encoded 454 amino acids，which had obviously SBP-domain and two zinc finger structures（Zn-1，Zn-2）and the bothway nuclear location signal（NLS）.Phylogenetic analysis suggested that MdSBP20 gene had the closer relationship with Pyrus bretschneideri（XM_009339726.1）and Malus domestica（XM_008376435.1）.Real-time PCR analysis showed that MdSBP20 gene p layed a role in response to low temperature，drought，and salt tolerance.Itwas inferred that QZ1 might has higher resistance than M26 nomatter in stress of low temperature，drought，and salt.Based on the results in this experiment，MdSBP20 gene had the significantly effects in apple rootstock response to abiotic stress.

Apple（Malus）；Abiotic stress；MdSBP20 gene；Gene clone；Expression analysis

Q78；S661.1 文献标识码：A 文章编号：1000-7091（2016）03-0051-07

10.7668/hbnxb.2016.03.008

2016-03-06

国家苹果产业技术体系项目（CARS280107）；“十二五”国家科技支撑计划项目（2013BAD02B01-2）；中央财政农业技术推广项目；山东省良种工程项目；山东省优秀中青年科学家奖励基金项目（BS2014SW 027）；青岛市科技计划项目（14-2-3-38-nsh）；青岛农业大学高层次人才科研基金项目（663/1114338）

沙 婷（1988-），女，内蒙古牙克石人，硕士，主要从事果树分子生物学研究。

祝 军（1962-），男，山东诸城人，教授，博士，主要从事果树生物技术研究。