玉米Zmcen基因的克隆、表达与生物信息学分析

雷海英，白凤麟，刘建霞，王志军

（1.长治学院生物科学与技术系，山西长治 046011；2.山西大同大学农学与生命科学学院，山西大同 037009；3.长治学院化学系，山西长治 046011）

玉米Zmcen基因的克隆、表达与生物信息学分析

雷海英1，白凤麟1，刘建霞2，王志军3

（1.长治学院生物科学与技术系，山西长治 046011；2.山西大同大学农学与生命科学学院，山西大同 037009；3.长治学院化学系，山西长治 046011）

为研究玉米Zmcen基因的特征及生物学功能，并对其编码蛋白结构与功能进行分析。以玉米cDNA为模板，将其构建到带有GST表达标签的原核表达载体pGEX-6p-1中，构建的重组载体pGEX-6p-ZmCen转化至大肠杆菌BL21（DE3），通过0.3 mmol/L IPTG在27℃下诱导表达20 h，获得了可溶性的GST融合蛋白。采用GST亲和层析柱对重组蛋白进行纯化，经12%SDS-PAGE电泳和GST标签抗体Western Blotting检测，鉴定为含有GST-Tag的融合蛋白，纯化的蛋白经PreScission Protease（PPase）过夜酶切切除GST标签，得到较纯的ZmCen蛋白；同时利用生物信息学的方法，解析ZmCen蛋白质的结构特征。结果表明，该基因定位于玉米第7#染色体上，全长基因含有6个外显子和7个内含子，519 bp的开放阅读框，编码172个氨基酸，分子量约为19.78 kDa，等电点为4.78。采用maizeGDB数据库对玉米整个生命周期的表达水平进行分析表明，细胞分裂旺盛的部位，Zmcen基因的表达量较高。对16种植物进行系统发育树分析显示，Zmcen基因与水稻、小麦、拟南芥等的centrin基因同源性高达80.21%，该结果为探索Zmcen蛋白的未知生物学功能提供了线索。

Zmcen基因克隆；表达；纯化；生物信息学

中心蛋白（Centrin，也叫Caltractin）是一个分子量约20 kDa的酸性蛋白，属于钙调蛋白超家族的成员，是微管组织中心（Microtubule-organizing centre，MTOC）的组成部分。有研究表明，一个中心蛋白含有4个EF-hand结构域，每个EF-hand结构域都是由一个“α螺旋-loop环-α螺旋”的结构组成，结合一个钙离子后发生构象变化而发挥其生物学功能［1-5］，迄今为止已经发现有1 000多种蛋白中存在这种结构。中心蛋白最早是在绿藻中发现的［6］，后来在酵母、原生动物、高等植物、哺乳动物等中都有发现［7-11］。目前，较多的研究主要集中在原核生物、人及低等植物的中心蛋白，而对于高等植物中心蛋白的报道比较少。有研究发现，高等植物中由于没有微管组织中心的结构，只能靠一些含微管蛋白的细胞器来行使类似的功能。其中心蛋白在细胞有丝分裂、纺锤体的分离、纤维的收缩等功能上起重要作用［3］。研究绿藻发现，其中心蛋白定位于细胞的细胞板、细胞核的表面及胞间连丝［12-14］；烟草的中心蛋白主要与微粒体相连，小部分在胞质的多聚蛋白复合物中，它在胞质分裂时参与细胞板的形成，也参与Ca2+在胞内的运输［15］；对水蕨（Marsilea）的研究发现，其中心蛋白翻译的中断影响了精子细胞中的微管分布，它可能控制着细胞骨架和运动型细胞器的形成［16］。而对于玉米ZmCen蛋白（Centrin）的研究，至今未见报道。

本研究克隆并表达了ZmCen蛋白，采用maizeGDB等数据库资源分析了Zmcen基因结构，并进行了生物信息学的分析，旨在为今后研究ZmCen蛋白的结构与功能、探索玉米中心蛋白影响细胞分裂分化机制的生物学功能奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验所用玉米材料为自交系郑58，BL21（DE3）由长治学院分子生物学实验室保存；原核表达载体pGEX-6p-1由山西大学分子研究所惠赠；总RNA提取试剂盒、Taq DNA聚合酶、反转录试剂盒、限制性内切酶、连接酶、凝胶回收试剂盒、小量质粒DNA制备试剂盒等均购自TaKaRa公司；引物合成、样品测序均由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2 试验方法

1.2.1 玉米总RNA的提取 cDNA第一链合成根据RT-PCR试剂盒（TaKaRa Reagents）说明，从约2周龄玉米叶片中提取总RNA（TRIzol法）后，采用微量核酸蛋白测定仪NanoDrop-2000（Thermo）检测RNA浓度后，吸取2μL去除基因组DNA，后反转录成cDNA第1链。合成的样品稀释10倍后储存于-20℃冰箱中备用。

1.2.2 Zmcen基因的CDS克隆 根据GenBank中基因登录号Zea mays caltractin（LOC100284444） mRNA报道的玉米基因的cDNA序列，使用Primer 5.0软件设计PCR扩增引物，上游引物为m F：5′-GCCGGATCCGGCGATGAGTTTCAACCAGT-3′，下游引物为mR：5′-GCCGTCGACCAGCG TCA AGCACTC ACAGA-3′（划线部分分别为Bam HⅠ、SalⅠ限制性内切酶酶切位点，下游引物上TCA为终止密码子）。PCR反应程序：94℃预变性5 min；94℃35 s，53℃40 s，72℃3 min，72℃7 min，34个循环。PCR产物用1%琼脂糖电泳检测目的基因。

1.2.3 Zmcen基因原核表达载体的构建及诱导表达、纯化 将目的基因片段与空载体pGEX-6p-1分别用Bam HⅠ、SalⅠ双酶切，纯化试剂盒回收PCR扩增产物，1%琼脂糖电泳回收线性载体。T4DNA连接酶于16℃连接过夜后，转化至大肠杆菌BL21感受态细胞，挑取阳性克隆后酶切并测序鉴定。

将测序鉴定正确的阳性克隆单菌落接种于2 m L含Amp的LB培养液中过夜培养，再取过夜培养物按1∶100的比例接种于500 m L含Amp的LB培养基中，培养菌液OD值为0.6～0.8时，加入IPTG（终浓度达0.3 mmol/L）诱导表达，27℃振荡培养20 h后离心收集菌体，菌体用PBS（140 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4，1.8 mmol/L KH2PO4，pH值7.3）缓冲液清洗1次，5 000 r/min离心10 min，向沉淀中加入15 m L PBS缓冲液，均匀吹打重悬菌体，加入PMSF及溶菌酶，冰浴20 m in后，超声波（频率为20 kHz，超声处理3～5 s，间隙3～5 s）破碎至菌悬液呈半澄清状态。10 000 r/min，4℃离心收集上清。取10μL蛋白样品中加入等体积的2×SDS上样缓冲液混匀，100℃煮沸5 min，12%SDS-PAGE电泳检测。

将表达的GST-ZmCen融合蛋白经GST（Glutathione SepharoseTM4B）亲和层析柱后，用PreScission Protease（PPase）以1 mg PPase/60 mg（GST融合蛋白）的比例4℃温浴过夜酶切。用1×PBS缓冲液洗脱后得到较纯的ZmCen蛋白，经12%SDS-PAGE电泳检测后-80℃冻存备用。

1.2.4 Western Blotting进一步检测目的蛋白 将纯化的融合蛋白经12%SDS-PAGE电泳后，参照分子克隆实验指南，将SDS-PAGE胶上的蛋白转移至硝酸纤维素膜，顺次进行一抗GST抗体、二抗羊抗鼠Ig抗体标记（北京中杉金桥），TBST（100 mmol/L Tris-HCl，1 500 mmol/L NaCl，20%Tween 20）缓冲液漂洗后放于显色液（AP Buffer 1 m L，BCIP 3.33 μL，NBT 13.33μL，中杉金桥）中，显色图像清晰时，浸入超纯水中终止反应。

1.2.5 Zmcen基因及蛋白的生物信息学分析 由测序正确的阳性克隆结果，利用玉米“maizeGDB数据库”对所克隆基因进行基因组结构、氨基酸的相对分子量、等电点、Zmcen基因在各器官及各个阶段的表达水平。采用EBI开源网站的Blast进行比对，用Clustal W对搜索的16种植物同源基因的氨基酸序列进行比对，构建了系统进化树［17］。

2 结果与分析

2.1 玉米Zm cen cDNA序列的扩增结果

提取的总RNA经RT-PCR扩增后，扩增产物由1%琼脂糖凝胶电泳检测，得到cDNA片段，与试验要求的Zmcen基因的条带位置在540 bp（加酶切位点和保护碱基）大小相符，可初步确定这些扩增片段为目的片段（图1-A）。回收扩增的片段连接并转化大肠杆菌BL21感受态细胞后，采用Bam HⅠ、SalⅠ进行双酶切验证正确（图1-B），送由上海生工测序验证，所克隆序列包含一个519 bp的开放阅读框，编码 172个氨基酸，无移码和突变，命名为pGEX-6p-Zmcen。

图1 Zm cen基因PCR扩增结果（A）和pGEX-6p-Zm cen阳性重组子双酶切产物（B）Fig.1 PCR am p lification of Zm cen gene and the recom binant p lasm id digested by restriction endonuclease of pGEX-6p-Zm cen p lasm id digested

2.2 Zm Cen蛋白的原核诱导表达结果

将转化成功的阳性克隆pGEX-6p-Zmcen-BL21菌株，经IPTG诱导表达的蛋白超声波处理后，12% SDS-PAGE电泳分析（图2-A），结果表明，在46 kDa处出现大量蛋白表达的条带，且大部分蛋白存在于上清液中，说明正确表达出GST融合蛋白，为可溶性蛋白。将表达的GST融合蛋白纯化并用PPase（PreS-cission Protease）切除GST标签后，12%SDS-PAGE电泳鉴定为与理论分子量相符的大小片段（图2-B）。

2.3 W estern Blotting结果分析

对原核表达的GST融合蛋白采用Western Blotting技术进行验证，结果显示，条带为预期的46 kDa大小，图像清晰，表明成功表达出GST融合蛋白（图2-C）。

图2 GST-Zm Cen融合蛋白纯化前后的12%PAGE电泳及W estern Blotting结果Fig.2 The resu lts of GST-Zm Cen fusion both before and after pu rified protein（A and B），and GST-Zm Cen p rotein W estern Blotting（C）

2.4 Zm cen基因结构分析

经maizeGDB数据库搜索，结果显示，所克隆的Zmcen基因位于玉米第7号染色体的第165 886 707～165 889 303位点处，基因组全长2 596 bp；Zmcen基因经基因组结构分析表明该基因含有6个外显子，7个内含子。对玉米ZmCen蛋白预测其理论分子量为19.78 kDa，等电点为4.78，显酸性。生物信息学分析结果表明，玉米ZmCen蛋白有4个EF-hand结构，与钙调蛋白的结构同源，每一个EF-hand结构结合一个Ca2+，执行钙信号传递的功能（图3）。

图3 Zm cen基因在第7#染色体上的定位及其Ca2+结合结构域Fig.3 Zm cen gene location im age on the 7#chrom osom e and its structure dom ain w ith Ca2+

图4 Zm cen基因在各部分组织表达的预测结果Fig.4 Zm cen gene expression in every part of the organization forecast resu lts

图5 16种植物centrin基因多序列比对Fig.5 M ultip le sequence alignm ent of 16 p lan ts species based on centrin gene sequences

Zmcen基因在各个器官不同生长阶段的表达水平如图4所示。根据颜色的深浅表示该基因在玉米整个生命周期各器官中的表达水平。从整体来看，玉米中心蛋白基因在根中的表达量较低，其次茎、雄穗、花药、花粉、种子、幼胚、胚乳逐渐增强。从图4还可以看出，玉米种子的种皮在授粉后的整个时期中都有表达，而种子在播种萌发24 h后表达水平比较大，当播种3 d后，种子内的表达量很少，同时在胚芽鞘以及初生根的表达水平较高。玉米雌穗的内苞叶和外苞叶的表达水平也较大。由以上表达水平的高低可以看出，处于旺盛生长分裂期的细胞中，Zmcen基因的表达水平均较高，反之，表达量降低，这也充分说明Zmcen基因跟玉米细胞有丝分裂相关的功能相吻合。

EBI数据库搜索“Centrin”关键词，筛选出了16种植物Centrin的氨基酸一级结构，采用DNAMAN本地软件序列比对，结果显示，所选16种植物同源性高达80.21%（图5）。从构建的系统发育树可以看出，玉米与水稻的亲缘关系最近，它们的蛋白同源性最高，聚为一类，它们与烟草、番茄等几种植物属于一个分支；拟南芥却与胡杨聚为一类，与葡萄、蓖麻等属于另一个分支（图6）。Centrin基因在各物种的保守程度极高，以及Centrin在物种中的普遍存在性，从而推断，Centrin在各物种中存在不可忽视的作用。

图6 16种植物Cen trin（caltractin）蛋白的系统发育树Fig.6 Genetic clustering analysis of 16 p lants species based on centrin gene

3 讨论

Centrin同钙调蛋白CaM的功能类似，是一种广泛存在于生物体中钙结合蛋白［18］，Centrin是一种酸性钙结合蛋白，在绿藻中主要参与细胞周期中基体的复制、分离、正确定位以及鞭毛的切除［19-20］。有研究报道，中心蛋白基因的4个EF-hand结构都含有共同的氨基酸序列，即DxDxDG［21］的模体，作为Ca2+的结合位点，中心蛋白结合钙离子后，构象会发生很大的变化，从“关闭式”状态变为“敞开式”，同时也伴随着大量疏水基团的暴露，形成了一个疏水腔，推测可能是目标蛋白的结合位点［3，22］。4个EF-hand结构分别位于蛋白的N末端、C末端结构域各2个。从氨基酸的序列分析，得知中心蛋白N-末端属于高变区，C-末端属于高度保守区［23］。绿藻的中心蛋白N末端和C末端发挥不同的功能，有不同的靶蛋白。N末端负责钙离子信号的传导，C末端则负责下游目标蛋白的结合［24-26］。在不同物种中，Ca2+的结合位点DxDxDG序列的高度保守性，暗示着中心蛋白执行着不可忽视的功能，以及天冬氨酸（D）作为Ca2+结合位点的意义重大。在拟南芥中已克隆到Atcen。有报道表明，拟南芥AtCen2存在于核中，参与核酸的切除修复［27］，Centrin或相关蛋白控制有丝分裂及纺锤丝的形成以及在物种中的高度同源，可推测中心蛋白基因在植物生长发育中的重要性。也有文献报道，该基因负责有丝分裂纺锤丝形成相关蛋白［28］。而对于Zmcen的研究目前尚未见报道。在本研究中克隆并表达了Zmcen蛋白，今后拟对玉米Zmcen基因调控细胞分裂分化机制、DxDxDG序列各位点的功能、ZmCen蛋白在玉米中的调控网络等生物学功能进行进一步研究。

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Cloning，Expression and Bioinform atics Analysis of M aize Zm cen Gene

LEIHaiying1，BAIFenglin1，LIU Jianxia2，WANG Zhijun3
（1.Department of Biology Science&Technology，Changzhi University，Changzhi 046011，China；2.College of Agronomy&Life Sciences，Shanxi Datong University，Datong 037009，China；3.Department of Chemistry，Changzhi University，Changzhi 046011，China）

To study the characteristics and biological function of Zmcen gene，investigate the protein structure of Zea mays L.，the ORF ofmaize Zmcen gene was cloned into the expression vector pGEX-6p-1 through PCR method，and the GST recombined expression vector pGEX-6p-Zmcen was constructed.Recombinant GST-ZmCen fusion protein was expressed as soluble protein in Escherichia coli BL21（DE3）after induction with 0.3 mmol/L IPTG at 27℃for 20 h.The ZmCen protein with the GST affinity chromatography and verified the protein by 12%SDSPAGE and Western Blotting with anti-GST antibody were purified.Fusion protein was cut out the GST-Tag by PPase and was purified.And by the method of biological information，the results showed that the Zmcen gene was located on the 7#chromosome，and the full-length gene had 6 exons and 7 introns.The ZmCen protein domain search and alignment analysis were conducted by themaizeGDB resources，and the ZmCen was EF-hand domain fam ily protein. The CDS region of Zmcen gene was 519 bp，encoding 172 am ino acid with a molecular weight of 19.78 kDa and p I of 4.78.Using maizeGDB database searching，the expression level analysis showed that Zmcen gene expression had a higher level in cells divided vigorous of the entire maize life cycle.The evolutionary history of centrins was analyzed by means of phylogenetic analysis in plants.The centrin gene was a highly 80.21%homology among centrins of 16 different p lants.The results of the research can provide a theoretical basis for exploring the unknown biologicalfunction of ZmCen protein.

Zmcen gene cloning；Expression；Purification；Bioinformatics

S512；Q71；Q78 文献标识码：A 文章编号：1000-7091（2016）03-0018-07

10.7668/hbnxb.2016.03.003

2016-01-08

国家自然科学基金项目（21201024）；山西省自然科学基金项目（2012021009-1）；山西省科技攻关项目（20140311005-3）

雷海英（1978-），女，山西平遥人，讲师，硕士，主要从事分子生物学教学与研究。

王志军（1980-），男，山西原平人，教授，博士，主要从事生物无机化学的教学与研究。