三维点扩散函数层距与图像复原的关系

梁日柳，陈　华，莫春球，聂　雄

(广西大学计算机与电子信息学院， 广西南宁530004)



三维点扩散函数层距与图像复原的关系

梁日柳，陈华，莫春球，聂雄

(广西大学计算机与电子信息学院， 广西南宁530004)

摘要：为研究三维点扩散函数层距与图像复原的关系，对数字共焦光学显微成像系统3D-PSF的构成、3D-PSF不同层距与图像复原效果的关系进行理论分析。通过仿真实验，研究了不同放大倍数的3D-PSF，在不同层距，相同层数和径向大小的情况下与图像复原效果的关系。实验表明：层距小于0.6 μm时，放大倍数为40倍，图像在层距为0.5 μm处取得最佳复原效果，放大倍数为20倍和10倍时，图像在层距为0.025 μm处取得较好的复原效果。研究结果为在细胞切片的采集和三维显微图像复原实际应用中对3D-PSF的层距选取提供了理论依据和选取方法。

关键词：三维点扩散函数；图像复原；层距；采样；改善信噪比

0引言

由于可以在传统的荧光显微镜基础上，利用数学算法去除图像中的离焦模糊成分，提高图像分辨率，数字共焦显微技术近年来迅速成为研究热点,以该技术发展的数字共焦显微仪在遗传学、医学、生物植物学等领域具有广泛的应用前景[1]。在该技术中，沿着z轴方向(即光轴或者轴向)移动生物细胞样本通过生物光学显微镜物镜焦平面，获取序列二维切片图像，然后使用三维显微图像复原算法进行处理[2]，获取清晰的二维图像序列和三维图像[3-6]。

在三维显微图像处理中，三维点扩散函数(three dimensional point spread function, 3D-PSF)的选取与图像复原效果密切相关。研究表明，3D-PSF层数越多，复原效果越好，但同时处理的时间也越长。当3D-PSF层数一定时，3D-PSF层距的选取与图像复原效果存在何种关系，一直是有待研究解决的问题。

本文在三种不同的放大倍数下，通过仿真实验，使用四种不同层数的细胞样本切片，研究不同层距，相同层数和径向大小的3D-PSF与图像复原的关系，为更好地获取高分辨率图像提供理论依据。

1光学显微成像系统3D-PSF

1.1三维点扩散函数结构

圆形孔径小散焦光学传递函数OTF的数学公式[7-9]如下：

(1)

其中w为散焦误差，q为频率，fc为系统截止频率。计算不同散焦量的光学传递函数，可以获得相应散焦量的2D-PSF，进而构成双锥体型3D-PSF[10]。

3D-PSF的空间大小包括轴向大小z和径向大小(x-y)，其在离散空域里可视为一个三维矩阵。沿着3D-PSF双锥体中心轴(z轴)不同的横截面(x-y面)，对应着一系列不同散焦量的径向二维点扩散函数(two dimensional point spread function, 2D-PSF)，其中z=0处的中间截面为焦面2D-PSF。

研究表明，3D-PSF的能量分布与放大倍数密切相关。三维点扩散函数的能量主要集中在双锥体中部的锥顶附近区域，放大倍数越大，在z轴方向，能量扩散程度越小，远离焦面z=0时能量迅速衰减，在径向(即x-y面)方向上，能量扩散程度越大，衰减速度缓慢，随着放大倍数减小，三维点扩散函数的能量在z轴方向扩散程度增大，衰减速度变缓，在径向方向上，三维点扩散函数的能量扩散程度小，主要分布在z轴周围，远离z轴时能量迅速衰减。

1.2不同层距3D-PSF与图像复原关系分析

图像复原处理采用的3D-PSF空间大小决定着复原效果和复原时间，3D-PSF空间大小选取越大，复原效果越好，同时处理的时间也越长。研究表明，3D-PSF的能量主要集中双锥体中部区域，因此在进行图像复原时，通常舍去3D-PSF周围大部分能量稀少的空间区域，而选取3D-PSF能量较为集中的中部区域。

将选取的3D-PSF以锥顶为中心，沿着z轴两端等间隔离散采样，获得一系列的2D-PSF构成新的3D-PSF，并对其进行适当修正，以免破坏3D-PSF的整体性。其中，每个3D-PSF仅层距不同，层数和径向大小相同。

可以预测，3D-PSF的层距太小或者太大都无法得到最佳复原效果，复原效果与层距的关系曲线呈现倒U的形状。即在相同层数和径向大小的3D-PSF下，图像复原效果随着3D-PSF层距增大而提高，当3D-PSF层距增大到临界值时，图像复原效果随着3D-PSF层距增大而下降。这是因为，当3D-PSF的层数固定时，层距太小使得3D-PSF的空间区域过小，只包含靠近焦面2D-PSF两侧的2D-PSF，无法有效地去除焦面的邻近平面造成的散焦信息，取得最佳复原效果，层距太大使得3D-PSF的空间区域过大，3D-PSF两端的部分2D-PSF远离焦面2D-PSF，无法有效还原焦面的细节，复原效果作用不大，甚至引起失真。

根据上述的分析，本文在三种不同的放大倍数下，使用不同层数的细胞样本切片，研究不同层距，相同层数和径向大小的3D-PSF与图像复原效果的关系。

2实验与分析

2.1制作3D-PSF

设显微镜物镜参数：放大倍数M=40，数值孔径NA=0.65；显微镜机械镜筒长度为160 mm；光源波长为550 nm；CCD参数为1/3英寸，像素值为640×480。

2.1.1制作显微镜物镜光学系统3D-PSF

根据光学传递函数制作一个直径为91(91×91)、层数为91、轴向采样间隔Δz(以下简称层距)为0.025 μm的光学系统3D-PSF，命名为h10，其中h10的40指放大倍数，大小为91×91×91。

2.1.2制作用于复原的层距不同层数相同的3D-PSF

对h10进行等间隔采样，获得径向大小、层数均为15的3D-PSF(15×15×15)，层距分别为Δz1=0.025 μm、Δz2=0.05 μm，…，Δz24=0.6 μm，分别命名为h10_0025、h10_005，…，h10_06，其中h10_0025中的40指放大倍数，0025指层距0.025 μm，得到一系列不同层距的h15.15.15[11-12]。

2.2制作三维仿真样本

图1为清晰图像、三种不同放大倍数下的模糊图像和复原图像。

使用图1(a)所示的清晰图像(151×151,256灰度级)作为初始的二维样本，通过旋转方式制作出351幅相互关联的二维图像，并将这351幅图像构建为三维清晰图像f(151×151×351)，分别将f与h10卷积得到三维仿真模糊切片图像g40，大小为151×151×351，层距为0.025 μm，图1(b)是位于g40中间层的图像。

分别用层距为Δz1、Δz2，…，Δz24对g40进行等间隔轴向采样，采样层数均为13层，得到第一组不同层距、相同层数和径向大小的三维模糊切片图像，分别命名为g40_13_0025、g40_13_005，…，g40_13_06,其中g40_13_0025的40指放大倍数，13指模糊切片层数，0025指层距0.025 μm，大小均为151×151×13。

同理，将采样层数增加为19层、25层、31层时，得到得到另外三组模糊切片图像，最大的层距分别为0.4 μm、0.35 μm和0.25 μm。

2.3仿真实验和结果分析

2.3.1图像复原

分别将四组三维模糊切片图像与相应层距的h15.15.15进行去卷积复原处理。采用经典的复原算法：最大似然法[13-14]，迭代次数为500次，分别记录复原时间，复原结果图像分别命名为fi40_13_0025、fi40_13_005等，fi40_13_0025中的40指放大倍数，13指模糊切片层数。0025指层距0.025 μm，图1(c)为fi40_13_05的中间层复原图像。

同理，将显微镜物镜参数依次修改为:①放大倍数M=20，数值孔径NA=0.45。②放大倍数M=10，数值孔径NA=0.25，其他条件不变再次进行仿真实验。

2.3.2不同层距的3D-PSF复原结果图像的改善信噪比

对得到的三维复原结果图像使用公式(2)进行改善信噪比ISNR计算。

(2)

其中：f、g和fi分别是三维清晰图像、三维模糊图像和三维复原结果图像(151×151)。ISNR值越大，表明图像的复原效果越好。

(a) f

(b) g40

(c) fi40_13_05

(d) g20

(e) fi20_13_0025

(f) fi20_13_06

(g) g10

(h) fi10_13_0025

(i) fi10_31_0175

图2为不同放大倍数、不同层数模糊切片图像下，相同层数和径向大小的3D-PSF层距与三维复原图像的ISNR关系曲线。

2.3.3结果分析

①对比图2(a)～图2(c)的曲线图可以看出，使用相同层距的h15.15.15对图像复原时，放大倍数越大，复原效果越好。同时，40倍时，ISNR曲线最先呈现出倒U的形状。这是因为在3D-PSF能量分布中，相同空间大小的3D-PSF，放大倍数越大，它所包含的能量越多，复原效果越好。

②从图2(a)可以看出，M=40倍时，ISNR曲线在Δz=0.1 μm处，得到最小值，随着层距的增加，ISNR曲线上升，在层距为0.5 μm处取得最大值，复原图像如图1(c)所示，继续增大层距，ISNR曲线下降，总体趋势呈现一个倒U的形状。这说明适当增大3D-PSF的层距，可以提高图像的改善信噪比。当层距过小时，h15.15.15的空间区域过小，只包含靠近焦面2D-PSF两侧的2D-PSF，无法有效去除焦面附近平面造成的模糊效果，复原效果不理想。增大层距，h15.15.15的空间区域随之增大，包含的2D-PSF携带更多的复原信息，图像清晰度逐渐改善最终得到最佳复原效果。再增大层距时，构成h15.15.15的部分2D-PSF远离焦面2D-PSF，复原作用减小，复原效果开始下降。

(a)M=40

(b) M=20

(c) M=10

③图2(b)中的曲线可以看出，M=20倍时，使用相同的h15.15.15复原19层、25层和31层的模糊切片，ISNR曲线在Δz=0.025 μm处取得最大值，在Δz=0.3 μm附近取得最小值，随着层距的增加，ISNR曲线呈上升趋势。这是因为放大倍数越小，3D-PSF能量在z轴方向上扩散程度越大，h15.15.15需要更大的层距才能包含有用的2D-PSF用于复原焦面图像，所以ISNR曲线逐渐上升，同时ISNR最大值将在较大的层距(Δz>0.5 μm)取得，层距继续增大，h15.15.15包含的2D-PSF无法有效复原焦面图像，ISNR曲线下降。

④在图2(c)中，10倍的复原效果曲线总体呈下降趋势，在Δz<0.6 μm时没有出现明显的上升趋势，这是因为相比40倍和20倍，10倍的3D-PSF能量在z轴方向上扩散程度最大，能量更加分散。在层距较小时，采样的2D-PSF过于相近，无法精确反映3D-PSF的能量分布。此时，将h15.15.15与相应层距的三维切片模糊图像进行处理时，复原效果恶化，ISNR曲线下降。依据M=10倍时3D-PSF的能量分布，随着层距的增大，10倍的ISNR曲线将会上升，同时取得最大值的层距比20倍的层距更大。

⑤图2(b)中13层模糊切片与其他不同切片层数的ISNR曲线不同，一直呈下降趋势，这是因为，图像的复原不仅与3D-PSF函数相关，也与切片的采样数量有关。如图1(f)所示在Δz=0.6 μm处，由于切片采样过少，3D-PSF无法有效还原邻近切片对焦面引起的散焦信息，复原效果不好。所以合适增加切片的采样，有助于模糊图像的复原。同理，在图2(c)中，由于切片采样层数多，使用相同的3D-PSF复原时，25层、31层切片的中间层模糊图像在Δz=0.2 μm附近取得较好的复原效果，如图1(i)所示。

研究结果表明，M=40时，3D-PSF层距为0.5 μm，图像可以得到最佳的复原效果，M=20和M=10时，3D-PSF层距为0.025 μm，可以获得较高的改善信噪比，如图1(e)和图1(h)。放大倍数为20倍、10倍时，ISNR曲线具体在多大的层距完整呈现出现倒U形，将在后续的实验进一步研究。

3结语

为研究三维点扩散函数层距与图像复原的关系,通过仿真实验,在三种不同放大倍数下，使用不同层距，相同层数和径向大小的3D-PSF与相应层距的三维仿真模糊图像去卷积,获得3D-PSF层距与三维图像复原效果的关系。实验表明，层距小于0.6 μm时，放大倍数为40倍，图像在层距为0.5 μm处取得最佳复原效果，放大倍数为20倍和10倍时，图像在层距为0.025 μm处取得较好的复原效果。本文研究结果为生物细胞切片的采样和三维显微图像复原实际应用中对3D-PSF的层距选取提供了参考，进一步提高3D-PSF空间大小与采样密度选取的科学性和确定性。

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(责任编辑梁碧芬)

收稿日期：2016-01-07；

修订日期：2016-03-01

基金项目：国家自然科学基金资助项目(61164019)；广西科学基金资助项目(2012GXNSFAA053216)

通讯作者：陈华(1958—)，广西桂平人，广西大学教授；E-mail: chenhua_cn@163.com。

doi:10.13624/j.cnki.issn.1001-7445.2016.0810

中图分类号：TP391

文献标识码：A

文章编号：1001-7445(2016)03-0810-06

On the relationship between the layer distance of three dimensional point spread function and image restoration

LIANG Ri-liu, CHEN Hua, MO Chun-qiu, NIE Xiong

(School of Computer, Electronics and Information, Guangxi University, Nanning 530004, China)

Abstract:In order to study the relationship between the three dimensional point spread function and the image restoration, the structure of 3D-PSF and the relationship between the effect of different layer distance and image restoration of digital confocal optical microscope imaging system are analyzed in theory. The relationship between the 3D-PSF of different distance and same layer number and radial amount is studied in different magnifications. Simulation results show that the best image restoration effect is obtained at the layer distance of 0.5 μm when the distance is less than 0.6 μm and the magnification is 40 times. When the magnification is 20 times or 10 times, better image restoration is achieved at the layer distance of 0.025 μm. The research results provide a theoretical basis for the selection of 3D-PSF layer distance in the practical application of the collection of cell sections and the practical application of three dimensional microscopic image restoration.

Key words:three dimensional point spread function(3D-PSF); image restoration; layer distance;sampling; improved signal to noise ratio (ISNR)

引文格式： 梁日柳，陈 华，莫春球.三维点扩散函数层距与图像复原的关系[J].广西大学学报(自然科学版)，2016，41(3)：810-815.