红嘴鸥中分离的非伤寒沙门菌分子特征分析

廖　凤，梁俊容，肖玉春，段　然，王　鑫，景怀琦，古文鹏



红嘴鸥中分离的非伤寒沙门菌分子特征分析

廖凤1，梁俊容2，肖玉春2，段然2，王鑫2，景怀琦2，古文鹏3

1.云南省第一人民医院，呼吸内科，昆明650022；2.中国疾病预防控制中心传染病所，北京102206；3.云南省疾病预防控制中心，急性传染病防制所，昆明650022

摘要:目的非伤寒沙门菌是一类肠道病原体，能引起人的腹泻性疾病。特从每年飞抵云南省昆明市的红嘴鸥中分离的非伤寒沙门菌，作分子分型研究，以反映红嘴鸥对于人群健康的潜在影响。方法从2013年11月-2014年1月间，分3次分别采集500份红嘴鸥粪便样本，进行沙门菌的分离培养。得到菌株之后开展药敏试验和脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析。结果500份粪便样品分离到78株非伤寒沙门菌，其中鼠伤寒沙门菌75株(96.15%)，韦尔克斯沙门菌1株，印第安纳沙门菌2株。药敏试验显示，所有非伤寒沙门菌对于利福平的耐药率高达97.44%，其次为萘啶酸(28.21%)和复方新诺明(25.64%)；而对庆大霉素和环丙沙星则完全敏感。PFGE结果显示，75株鼠伤寒沙门菌形成了3个带型，并且带型之间的同源性关系均大于95%，66株表现为完全一致的带型特征。与分离自病人的鼠伤寒沙门菌比较后发现，红嘴鸥中分离的鼠伤寒沙门菌与病人分离的菌株的PFGE带型被区分成了两个聚类群。结论红嘴鸥有很高的非伤寒沙门菌携带率，以鼠伤寒沙门菌为主；PFGE结果表明，红嘴鸥携带的非伤寒沙门菌可能与其生活环境和食物构成等因素密切相关，但尚未发现这些菌株与人群患病的相关性。

关键词:红嘴鸥；非伤寒沙门菌；脉冲场凝胶电泳

Molecular characteristics of non-typhoidSalmonellaisolated fromLarusridibundusin Kunming, China

Supported by the National Sci-Tech Key Project (No. 2012ZX10004-212)

非伤寒沙门菌是人类胃肠炎和肠道外感染的主要病原体，是引起细菌性腹泻的主要病原菌之一，而又以鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌为主要血清型[1]。非伤寒沙门菌广泛存在于外环境和各类宿主动物中，人类的感染常与消费污染的食物有关，几乎可以从所有的食物中分离到非伤寒沙门菌。同时，各种家养动物和野生动物中均有分离到非伤寒沙门菌的报道[2]。

红嘴鸥是分布于欧亚大陆和北美洲东部沿海的一种候鸟，体型与毛色都与鸽子相似，嘴和脚都呈红色，身体大部分的羽毛是白色[3]。中国的新疆、内蒙、黑龙江等地是其繁殖地。每年冬季大量的红嘴鸥从北方西伯利亚地区迁徙到中国南方越冬，其越冬地区分布广泛，从中国的东北地区南部一直到东南部地区均有分布。自上世纪80年代以来，每年冬季的11月份至次年的3月份，数以万计的红嘴鸥进入昆明地区的大小湖泊进行越冬。每年这个时刻，总有许多游客前往红嘴鸥的栖息地对其进行投食和观看，人们总是能近距离的与红嘴鸥进行接触[4-5]。因此，弄清红嘴鸥携带的肠道病原菌及其分布规律，特别是沙门菌的分布特征有利于对于此类候鸟的管理，同时能够弄清红嘴鸥携带的致病菌分布规律与其生活环境之间的相关性。

1材料和方法

1.1样本采集我们对冬季飞抵昆明过冬的海鸥粪便进行了采集，共采集粪便样本500份。采集时间为2013年的11月、12月与2014年的1月份，共分了3个时间段进行采集，每份采集的新鲜粪便标本直接接种于SBG增菌液，并送回实验室，37 ℃培养24 h。1.2沙门菌的分离、鉴定将所有SBG增菌液增菌后的标本接种于麦康凯、XLD和SS琼脂平板中，37 ℃培养24 h。对所有平板中分离到的可疑沙门菌菌株采用Vitek Compact2(梅里埃)全自动生化鉴定仪进行系统的生化鉴定。同时，采用沙门菌诊断血清(泰国S&A公司)对所有生化确认后的菌株进行血清型别的鉴定。

1.3药敏试验采用K-B药敏纸片法进行抗生素药敏试验，药敏试验结果判定根据美国临床实验室标准化协会(CLSI)制定的微生物敏感试验执行。采用ATCC25922大肠埃希氏菌为质控菌株，选取10种抗生素作为研究对象。分别为：氨苄西林(AMP)，阿莫西林/克拉维酸(AMC)，头孢噻吩(CFT)，头孢噻肟(CTX)，GEN(庆大霉素)，萘啶酸(NAL)，环丙沙星(CIP)，四环素(TET)，利福平(RFA)和磺胺甲基异恶唑/甲氧苄啶(SMZ)。

1.4PFGE具体操作过程见参考文献[6]，并按照PulseNet的沙门菌标准操作程序进行实验和参数设置(Auto Algorithm: 30kb-low MW, 700 kb-high MW，电泳时间为19 h)，每块胶的酶的用量为XbaⅠ 45U。37 ℃分别酶切2 h。电泳结束后用GelRed核酸染料染色30 min，纯水脱色30 min，凝胶成像仪上读取图像。

聚类分析采用BioNumerics V6.6软件进行聚类分析，应用非加权组平均法(UPGMA)，聚类相似性系数采用基于条带比较的Dice。Dice=2×N/(N+M)，N表示能匹配的条带个数，M表示所有的条带个数(2株菌带型上的条带数总和再减去匹配的条带数)。

2结果

2.1菌株分离、鉴定结果500份红嘴鸥粪便中共分离出非伤寒沙门菌78株，其中以鼠伤寒沙门菌为主，共75株，占96.15%。其次分离到2株印第安纳沙门菌和1株韦尔克斯沙门菌。

2.2药敏试验结果所有非伤寒沙门菌对于利福平的耐药率最高，为97.44%，其次为萘啶酸(28.21%)和复方新诺明(25.64%)；而对庆大霉素和环丙沙星则完全敏感。其中出现的两株对氨苄西林等β-内酰胺内抗生素耐药的菌株为1株印第安纳和韦尔克斯沙门菌，见表1。

表1红嘴鸥中分离的非伤寒沙门菌抗生素药敏试验结果

Tab.1Antibiotics resistant results of non-typhoid Salmonella isolated from Larus ridibundus

抗生素AntibioticsS(敏感)/数Sensitive/Number率(%)Percent(%)I(中介)/数Medium/Number率(%)Percent(%)R(耐药)/数Resistant/Number率(%)Percent(%)AMP7697.4400.0022.56AMC7697.4400.0022.56CFT7798.7200.0011.28

表1(续)

抗生素AntibioticsS(敏感)/数Sensitive/Number率(%)Percent(%)I(中介)/数Medium/Number率(%)Percent(%)R(耐药)/数Resistant/Number率(%)Percent(%)CTX7798.7200.0011.28GEN7810000.0000.00NAL5671.7900.002228.21CIP7810000.0000.00TBT7798.7211.2800.00RFA22.5600.007697.44SMZ5874.3600.002025.64

2.3PFGE结果PFGE结果显示，75株鼠伤寒沙门菌形成了3个带型，并且带型之间的同源性关系均大于95%，66株则表现为完全一致的带型特征。与分离自昆明地区鼠伤寒沙门菌的病人PFGE带型比较后发现，红嘴鸥中分离的鼠伤寒沙门菌与病人分离的菌株的PFGE带型被区分成了2个聚类群，尚未发现红嘴鸥分离菌株与病人分离菌株具有同源性关系，见图1。而2株印第安纳沙门菌和1株韦尔克斯沙门菌则形成了不同的聚类群。

3讨论

每年冬季红嘴鸥总会从西伯利亚地区飞到云南省昆明市越冬，红嘴鸥主要栖息在城市内的一些河流和湖泊，而这些地区往往是旅游者和人群较为集中的区域。因此，人群具有密切接触该类野生动物的可能性，而红嘴鸥本身携带的病原菌可能会给人群带来一定的潜在的健康危险[4]。既往对于红嘴鸥的病原分析主要集中于禽流感病毒等病毒性疾病的携带情况，而忽略了细菌性病原体的研究和分析，对于人群健康来说，细菌性病原体的研究同样重要，到目前为此，还没有一项研究涉及到红嘴鸥携带沙门菌的分析。从本研究结果可以看出，红嘴鸥中分离出的非伤寒沙门菌以鼠伤寒沙门菌为主，这是引起细菌性食物中毒最主要的病原菌之一，应该引起人们足够的重视。虽然在我们的结果中尚未发现红嘴鸥分离的鼠伤寒沙门菌与当地病人分离菌株之间的同源性关系，但其潜在的致病性还是存在的，同时存在着大量人群的密切接触情况[7-8]。因此，对于密切接触此类野生动物的人群开展健康宣传，做好预防、保健工作具有十分重要的公共卫生意义。

注：ho-241,408为印第安那沙门菌；ho-287为韦尔克斯沙门菌，其余均为鼠伤寒沙门菌。Note: ho-241 and 408 were Salmonella Indiana; ho-287 was Salmonella waycross, others were Salmonella typhimurium.图1　红嘴鸥分离非伤寒沙门菌PFGE聚类图Fig.1　PFGE results of the non-typhoid Salmonella isolated from Larus ridibundus

从另一个方面来看，分离出的鼠伤寒沙门菌与感染鼠伤寒沙门菌的患者的菌株无同源性关系，而红嘴鸥分离出的这些菌株之间的同源性关系非常接近，大部分菌株为同一个克隆群的菌株，表明红嘴鸥携带的非伤寒沙门菌主要反映了其生存环境或是其饮食习性。这些菌株可能反映了红嘴鸥生活的水体环境，以及水体环境中的藻类、小鱼、小虾等食物中普遍存在着这类非伤寒沙门菌；而以红嘴鸥为代表的这一类野生动物与人类或是家养动物之间生活在不同生态位中，因此未发现他们之间的同源性关系[9]。

参考文献：

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DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2016.04.010

通讯作者：古文鹏，Email: gu_02788@163.com

中图分类号：378.2

文献标识码：A

文章编号：1002-2694(2016)04-0367-04

Corresponding author:Gu Wen-peng, Email: gu_02788@163.com

收稿日期：2015-09-02修回日期：2015-12-02

LIAO Feng1, LIANG Jun-rong2, XIAO Yu-chun2, DUAN Ran2,WANG Xin2, JING Huai-qi2, GU Wen-peng3

(1.DepartmentofRespiratoryMedicine,theFirstPeople’sHospital

ofYunnanProvince,Kunming650022,China;2.ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China;3.YunnanProvincialCentersforDiseasesControlandPrevention,Kunming650022,China)

Abstract:We isolated non-typhoid Salmonella from L.ridibundus in Kunming every year, and performed the molecular typing methods, for refecting the potential influence for human health. Three times of feces collections were performed from Nov 2013 to Feb 2014, and totally 500 feces were acquired from L.ridibundus. We isolated the non-typhoid Salmonella and performed the antibiotics resistant test and pulsed-eld gel electrophoresis (PFGE). Results showed that 78 non-typhoid Salmonella strains were isolated from all the feces, and 75 strains (96.15%) were S.typhimurium, one was S.waycross, and two S.indiana were also found. The antibiotics resistant tests showed that 97.44% of all the strains were resistant to rifampin, 28.21% to nalidixic acid, and 25.64% to sulfamethoxazole/trimethoprim. However, all the strains were sensitive to gentamicin and ciprofloxacin. The PFGE results showed 75 S.typhimurium were divided into three patterns, and the similarity of three patterns was greater than 95%. Of 66 strains showed the same PFGE pattern in the study. Comparing the PFGE patterns with patients in our database, we found that S.typhimurium isolated from L.ridibundus were different from patients, separating into two groups. The carrier rate of non-typhoid Salmonella were very high in L.ridibundus, mainly for S.typhimurium. The PFGE results reflected the strains isolated from L.ridibundus maybe had the relations with their living environment or eating habits. No correlations were found between L.ridibundus and patients in our study.

Keywords:Larus ridibundus; non-typhoid Salmonella; pulsed-field gel electrophoresis

国家“十二五”科技重大专项(No.2012ZX10004-212)资助