Ⅱ型登革病毒非结构蛋白1多克隆抗体制备和免疫特征分析

杨小猛　赵丹　杜丽伟　陈相　江丽芳



Ⅱ型登革病毒非结构蛋白1多克隆抗体制备和免疫特征分析

杨小猛1赵丹2★杜丽伟1陈相1江丽芳3

［摘要］目的制备抗Ⅱ型登革病毒（dengue virus type 2，DENV2）非结构蛋白1（nonstructural protein 1，NS1）多克隆抗体，分析该抗体的免疫特性。方法采用NS1蛋白免疫BALB/c小鼠，取血分离血清，纯化获得抗NS1抗体。酶联免疫吸附试验法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）分析抗NS1抗体与NS1蛋白和DENV2结合特性。免疫荧光法测定抗NS1抗体与人微血管内皮细胞株1 （human microvascular endothelial cell 1，HMEC⁃1）的交叉反应性。ELISA法分析抗NS1抗体、HMEC⁃1和新鲜同系小鼠血清共培养体系中活化补体的含量。结果抗NS1抗体能与NS1和DENV2特异性结合，抗体最高滴度分别为1∶1 280和1∶640。抗NS1抗体能与HMEC⁃1细胞交叉结合，抗NS1抗体、HMEC⁃1和新鲜同系小鼠血清共培养上清液中C3a、C4a、C5a和sC5b⁃9含量均显著高于HMEC⁃1和新鲜同系小鼠血清共培养（均P<0.05），以及PBS、HMEC⁃1和新鲜同系小鼠血清共培养（均P<0.05）。结论抗DENV2 NS1抗体能交叉结合于血管内皮细胞并激活补体系统，可能在登革出血热的免疫病理机制中起重要作用。

［关键词］Ⅱ型登革病毒；非结构蛋白1；抗非结构蛋白1抗体；膜攻击复合物

登革病毒（dengue virus，DENV）特异性抗体可以通过3种机制清除病毒：病毒中和效应、补体依赖的细胞毒效应和抗体依赖细胞介导的细胞毒效应［1］。然而DENV特异性抗体也可能引起免疫损伤，免疫机制或自身免疫机制可能与DENV感染的致病机制有关［2］。研究表明，DENV非结构蛋白1（nonstructural protein 1，NS1）与病毒感染宿主的血小板和血管内皮细胞存在相似的抗原表位，抗DENV NS1抗体可能破坏宿主的血小板和血管内皮细胞［3］，但其具体机制目前仍不完全清楚。为探讨抗DENV NS1抗体在DENV感染病理机制中的作用，本研究制备了高效价抗Ⅱ型登革病毒（dengue virus type 2，DENV2）NS1抗体，分析该抗体与人微血管内皮细胞1（human microvascu⁃lar endothelial cell 1，HMEC⁃1）的交叉反应性以及激活补体系统的能力，探讨NS1蛋白介导的体液免疫应答在登革出血热的免疫病理机制中的作用。

1　材料与方法

1.1实验动物与试剂

SPF级雌性BALB/c小鼠（3~6周龄）购自中山大学实验动物中心，实验动物许可证号为SCXK（粤）2004⁃0011/粤监证字2012A045。RPMI⁃1640培养液购自美国Gibco公司，使用前添加终浓度的10 mmol/L L⁃谷氨酰胺、10 ng/mL表皮生长因子、1 μg/mL氢化可的松和5%的热灭活胎牛血清，C3a、C4a、C5a和sC5b⁃9酶联免疫吸附试验（en⁃zyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒购自深圳达科为公司。

1.2基因工程菌和细胞株

含DENV2 NS1基因的基因工程菌（X⁃33/ pPICZαB⁃NS1）由中山大学中山医学院微生物教研室构建并保存。HMEC⁃1细胞由美国疾病控制与预防中心赠送。

1.3DENV2 NS1蛋白的表达和抗NS1抗体的制备

参照以往的方法［4］，采用DENV2 NS1基因工程菌表达NS1蛋白。取100 μg NS1蛋白溶于0.25 mL生理盐水，加入等体积弗氏完全佐剂充分乳化，腹腔注射BALB/c小鼠。第21天取50 μg NS1蛋白溶于0.25 mL生理盐水，加入等体积弗氏完全佐剂充分乳化，腹腔注射BALB/c小鼠。第31天时采用ELISA法测定小鼠血清中抗NS1抗体滴度，若抗体滴度低于1∶10 000，则同第21天方法再次加强免疫。最后采用眼球摘除法收集小鼠血液，离心分离血清。采用二乙氨基乙基纤维素柱纯化血清中抗NS1抗体，并经0.22 μm的除菌滤器除菌，-20℃保存备用。

1.4抗NS1抗体与NS1蛋白和DENV2结合能力分析

取96孔空白平板，第A至D行用NS1蛋白包被，第E至H行用灭活DENV2包被，整板经5%胎牛血清4℃封闭过夜。滴度为1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1 280、1∶2 560和1∶5 120的抗NS1抗体依次加入第1至10列，滴度为1∶20的抗DENV2多克隆抗体加入第11列，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）加入第12列，每孔100 μL。平板置37℃、45 min，洗板。每孔加入100 μL辣根过氧化物酶标记的抗小鼠IgG抗体（滴度为1∶40 000），37℃、60 min，洗板。每孔加入100 μL酶反应底物，37℃、40 min，每孔加入50 μL终止液，轻微振荡混匀，酶标仪测定每孔OD450。以PBS孔为阴性对照，按公式计算每孔截断值（the cut off value，Cut off），Cut off=测定孔OD450/阴性对照孔OD450。以Cut off值≥2.1确定抗体的最高滴度。

1.5抗NS1抗体与HMEC⁃1细胞的交叉反应性分析

HMEC⁃1细胞爬片培养于RPMI⁃1640液，待长满载玻片后，固定液（50%甲醇和50%丙酮）固定载玻片20 min。分成3组，分别滴加100 μL抗DENV E蛋白抗体（抗E抗体，用作无交叉反应对照）（滴度1∶10）、抗NS1抗体（滴度1∶10）和抗NS1抗体（滴度1∶50），4℃、30 min。PBS冲洗，滴加100 μL FITC标记的抗小鼠IgG抗体，阴凉避光处30 min，PBS冲洗。采用奥林巴斯BX⁃51型荧光显微镜分析载玻片荧光强度。

1.6抗NS1抗体激活补体活性测定

共培养体系分为抗NS1抗体组、同系小鼠血清组和PBS对照组，每组6瓶。取规格为25 cm2的直角斜颈透气培养瓶，HMEC⁃1细胞培养于RPMI⁃1640液中。待细胞贴壁长至2/3，无菌吸出培养液。抗NS1抗体组加入1 mL抗NS1抗体、1 mL新鲜同系小鼠血清和3 mL RPMI⁃1640液，同系小鼠血清组1 mL新鲜同系小鼠血清和3 mL RPMI⁃1640液，PBS对照组加入1 mL PBS、1 mL新鲜同系小鼠血清和3 mL RPMI⁃1640液。3组均置于37℃、5% CO2环境培养6 h。收集上清液，采用ELISA法按试剂盒说明书测定C3a、C4a、C5a和sC5b⁃9的含量。

1.7统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，实验数据以均数±标准差表示，两组间比较采用成组设计的t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1抗NS1抗体制备，抗NS1抗体与NS1蛋白和DENV2结合能力分析

BALB/c小鼠经基础免疫后第21天，滴度为1∶1 280的抗血清Cut off值为1.49，小于2.1，再次加强免疫。第31天滴度为1∶1 280的抗血清Cut off值为4.35，为获得较高滴度的抗血清进行后续实验，再次加强免疫，第41天滴度为1∶1 280的抗血清Cut off值为10.32（图1）。抗血清经纯化处理获得的抗NS1抗体能与NS1蛋白、灭活的DENV2特异性结合，抗体最高滴度分别为1∶1 280和1∶640（图2）。

2.2抗NS1抗体与HMEC⁃1细胞的交叉反应性

当第一抗体为抗NS1抗体时，HMEC⁃1细胞爬片上可见绿色荧光，抗NS1抗体的滴度越大，结合强度越弱；当第一抗体为抗E抗体时，HMEC⁃1细胞爬片上几乎无绿色荧光（图3）。

2.3抗NS1抗体激活补体活性

抗NS1抗体组上清液中C3a、C4a、C5a和sC5b⁃9的水平均显著高于同系小鼠血清组和PBS对照组（均P<0.05），而上述指标在同系小鼠血清组和PBS对照组间均无显著性差异（均P>0.05）（表1）。

3　讨论

DENV感染可导致宿主发生登革出血热/登革休克综合征，其临床症状主要表现为严重的血小板减少、血浆渗漏和肝肿大［5］。近年来研究发现免疫或自身免疫反应在DENV感染的致疾机制中发挥重要作用［6⁃7］，病毒感染导致的自身免疫病病理机制仍不明确，目前认为与分子模拟、旁观者激活和病毒持续感染等因素有关［8］。

自身免疫反应是DENV感染所致疾病的一种重要机制，而NS1蛋白以及抗NS1抗体在这一机制中尤为关键［9-10］。NS1蛋白是DENV重要的非结构蛋白，是病毒生存必需的，其确切功能还不清楚。NS1蛋白是一种高度保守的糖蛋白，以可溶性形式存在于感染细胞内或细胞表面，是DENV感染过程中体液免疫反应的主要靶分子［11］。分子模拟机制导致的自身免疫反应与DENV感染所致疾病的病理机制有关，NS1蛋白诱导的自身抗体可以与细胞外基质、血液凝块、整联蛋白/外源凝集素蛋白反应，并且能够与血小板、内皮细胞结合［12⁃13］。患者血清中抗NS1抗体与内皮细胞发生交叉反应，导致内皮细胞功能紊乱和凋亡，在疾病进展中发挥重要作用［14］；抗NS1抗体与血小板和内皮细胞结合还能导致血小板和内皮细胞的破坏和炎性激活。用NS1蛋白预处理可以抑制DENV患者血清引起的血管内皮细胞凋亡［15］，以上研究提示DENV NS1蛋白可能与血小板、血管内皮细胞具有相似的抗原决定簇，DENV感染能够通过分子模拟机制导致疾病的发生［16］。本研究发现抗NS1抗体能够与人微血管内皮细胞结合，且结合强度与抗NS1抗体滴度呈正相关，结果提示抗DENV NS1抗体能够与血管内皮细胞发生交叉反应。

抗原抗体反应可激活机体补体系统，产生多种具有炎症介质作用的过敏毒素C3a、C4a和C5a，以及直接损伤靶细胞的攻膜复合体。抗NS1抗体与血管内皮细胞发生交叉反应，能够活化补体，损伤病毒感染宿主血管内皮细胞，引起登革出血热/登革休克综合征患者血浆渗漏［17］。以往研究发现登革出血热/登革热患者血清中C3a和C5a均显著升高，并且C3a和C5a与登革发病的严重程度密切相关［18］。本研究发现抗NS1抗体与人微血管内皮细胞、新鲜血清共培养产生大量C3a、C4a和C5a，以及可溶性攻膜复合体sC5b⁃9，结果提示抗NS1抗体与人微血管内皮细胞交叉结合后能够激活补体系统。

综上所述，DENV NS1蛋白是病毒感染致病过程中的重要蛋白，机体产生的抗NS1抗体能够与宿主血管内皮细胞交叉反应并激活补体系统，与登革出血热/登革休克综合征患者的血浆渗漏有关。

表1　抗NS1抗体激活补体活性的测定结果Table 1　The levels of the activated complement mobilized by anti⁃NS1 antibodies measured using ELISA

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2.深圳市罗湖区慢性病防治院，广东，深圳518023

3.中山大学中山医学院，广东，广州510080

★通讯作者：赵丹，E⁃mail：sysu_microbiology@126.com

基金项目：国家自然科学基金和广东省自然科学基金联合项目（U0632002）；深圳市科技计划项目（JCYJ20120830091748817）

作者单位：1.深圳市罗湖区妇幼保健院，广东，深圳518019

Preparation and immune signature analysis of anti⁃dengue virus type 2 nonstructural protein 1 in vitro

YANG Xiaomeng1，ZHAO Dan2★，DU Liwei1，CHEN Xiang1，JIANG Lifang3
（1.Shenzhen Luohu Maternity and Child Healthcare Hospital，Shenzhen，Guangdong，China，518019；2.Shenzhen Luohu Chronic Disease Control，Shenzhen，Guangdong，China，518023；3.Zhongshan School of Medicine，Sun Yat⁃sen University，Guangzhou，Guangdong，China，510080）

［ABSTRACT］ObjectiveTo prepare the polyclonal antibodies directed against dengue virus type 2 (DENV2)nonstructural protein 1(NS1)(anti⁃NS1 antibodies)and to analyze the immunological characteristics of the antibodies.MethodsHigh titer polyclonal anti⁃NS1 antibodies were obtained from BALB/c mice immunized with DENV2 NS1.The binding ability of anti⁃NS1 antibodies to NS1 protein or DENV2 was detected by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA).The cross⁃reactivity of the antibodies with human microvascular endothelial cell 1(HMEC⁃1)was demonstrated using immunofluorescence assay.The levels of activated complement in the co⁃culture systems of anti⁃NS1,HMEC⁃1 and fresh syngenic mice sera were measured using ELISA.ResultsAnti⁃NS1 antibodies could bind to NS1 and DENV2.The highest titer ofthe antibodies was 1:1 280 and 1:640 respectively.Anti⁃NS1 antibodies could cross bind to HMEC⁃1.The levels of C3a,C4a,C5a and sC5b⁃9 in the co⁃culture systems of anti⁃NS1,HMEC⁃1 and fresh syngenic mice sera were sharply higher than those in the co⁃culture systems of HMEC⁃1 and fresh syngenic mice sera(P< 0.05)and the co⁃culture systems of PBS,HMEC⁃1 and fresh syngenic mice sera(P<0.05).Conclusion These results indicate that anti⁃NS1 antibodies can crosslink to vascular endothelial cell and activate the complement system,which may be involved in the immunopathologic mechanism of dengue hemorrhagic fever.

[KEY WORDS]Dengue virus type 2;Nonstructural protein 1;Anti⁃nonstructural protein 1 antibodies; Membrane attack complex