中国型Gγ+(Aγδβ)0地中海贫血的基因诊断和临床特征分析

王继成　秦丹卿　骆明勇　何天文



中国型Gγ+(Aγδβ)0地中海贫血的基因诊断和临床特征分析

王继成秦丹卿骆明勇何天文★

［摘要］目的对42例中国型Gγ+(Aγδβ)0地中海贫血患者进行基因诊断并分析其临床特征。方法所有患者的外周血标本进行血红蛋白毛细管电泳和包括平均红细胞体积（mean corpuscular volume，MCV），平均血红蛋白含量（mean corpuscular hemoglobin，MCH）等红细胞参数的分析，应用Gap⁃PCR、PCR ⁃RDB的方法进行地中海贫血基因检测。结果40例患者为中国型Gγ+(Aγδβ)0杂合子，血红蛋白正常或轻度下降，血红蛋白分析显示HbF为10.6%～20.6%；2例为中国型Gγ+(Aγδβ)0合并其它常见的β地中海贫血，表现为中重度的贫血，HbF为80.8%～93.1%。结论中国人群中中国型Gγ+(Aγδβ)0是比较常见的缺失型β地中海贫血类型，其杂合子临床症状较轻，当合并其他地中海贫血时可改变原有的血液学表现。

［关键词］β地中海贫血；δβ地中海贫血；基因诊断

地中海贫血简称地贫，又称海洋性贫血，是我国南方常见的遗传性血液学疾病，主要分α地中海贫血（简称α地贫）和β地中海贫血（简称β地贫）2种类型。β地贫主要是由β珠蛋白基因的点突变引起，少数是由于β珠蛋白基因簇的大片段缺失所致。δβ地贫是一类累及δ和β珠蛋白基因的缺失型地贫。这种缺失导致胎儿期的γ珠蛋白基因在成人期重新开放和持续表达，从而导致HbF的异常升高［1］。目前全世界已发现多种不同缺失类型的δβ地贫。在我国人群中，中国型、云南型和广州型的δβ地贫已被报道，这些类型都是Gγ+（Aγδβ）0地贫，其中中国人最常见的是中国型Gγ+（Aγδβ）0地贫［2-5］。这种地贫首先由Mann等［6］人在上世纪70年代报道。我们对42例中国型Gγ+（Aγδβ）0地贫患者进行基因诊断并分析其临床特征，报告如下。

1　对象与方法

1.1对象

2012年至2015年来我院就诊，血红蛋白电泳显示HbF增高（>5%）且经基因检测确诊为中国型Gγ+（Aγδβ）0地贫的42例的患者。所有患者均为广东籍居民，年龄为18~38岁，平均年龄为27.6岁。取其外周血用于血常规和血红蛋白电泳分析，提取外周血基因组DNA用于珠蛋白基因检测。

1.2方法

1.2.1红细胞参数和血红蛋白分析

提取EDTA抗凝静脉血2 mL，用深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司的BC⁃2000血液分析仪对外周血进行红细胞参数分析。抽取柠檬酸钠抗凝静脉血2 mL，应用法国SEBIA公司的se⁃bia capillary2毛细管电泳分析系统进行血红蛋白分析。

1.2.2地贫基因诊断

使用QIAmp DNA Blood Mini Kit试剂盒提取外周血基因组DNA。应用亚能生物技术有限公司的地贫基因检测试剂盒进行基因检测，包括3种最常见的缺失型α地贫（⁃⁃SEA/、⁃α4.2、⁃α3.7）、3种最常见的点突变型α地贫（CS、WS、QS）以及17种常见的β地贫，操作严格按照试剂盒说明书进行。采用裂隙聚合酶链反应（gap polymerase chain reaction,Gap⁃PCR）的方法检测中国型Gγ+（Aγδβ）0地贫，Gap⁃PCR引物委托铂尚生物技术（上海）有限公司合成。PCR扩增反应体系是3条引物双重Gap⁃PCR，3条引物的序列分别为：共同上游引物5′⁃CCAGCCTCATGGTAGCAGAATC⁃3′，缺失下游引物5′⁃TGGTATCTGCAGCAGTTGCC⁃3′，正常内对照下游引物5′⁃GTGATTGTTGAGTTGCAG⁃GATCG⁃3′。中国型Gγ+（Aγδβ）0地贫缺失扩增产物长度为211 bp，正常内对照扩增产物长度为298 bp。PCR扩增反应条件为95℃预变性5 min，94℃变性45 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环，最后72℃延伸7 min，琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物。

2　结果

2.1血液学和血红蛋白电泳

40例中国型Gγ+（Aγδβ）0杂合子患者的血液学指标表现差别较大，血红蛋白正常或轻度降低；MCV和MCH有不同程度的下降，提示小细胞低色素性贫血的特征。血红蛋白电泳分析显示HbA2为2.3%~3.1%，HbF为10.6%～20.6%；2例为中国型Gγ+（Aγδβ）0复合其它常见的β地中海贫血，表现为中重度贫血，HbF大幅增高到80.8%～93.1%（表1）。

表1　红细胞参数、血红蛋白电泳及基因检测结果Table 1　Results of hemotological parameters and gene diagnosis

2.2基因检测结果

应用基于反向斑点杂交方法的β⁃地贫基因检测试剂盒检测到2例突变，分别为⁃28和CD17纯合突变，PCR⁃RDB结果见图1。用Gap⁃PCR法共检测，42例为中国型Gγ+（Aγδβ）0缺失型地贫。PCR琼脂糖凝胶电泳图见图2，其中298 bp为正常对照的扩增产物，211 bp为缺失型条带。

3　讨论

中国型Gγ+（Aγδβ）0地贫的缺失范围约100 kb，包括部分Aγ珠蛋白基因、全部的δ和β珠蛋白基因以及β珠蛋白基因下游较远的具有调控功能的DNA序列［7-8］。这种缺失致使Gγ珠蛋白基因的高表达，从而使HbF在胎儿出生后的持续性升高（5%~20%）和小细胞低色素性贫血成为中国型Gγ+（Aγδβ）0特征性的临床表现［9］。HbF是胎儿期表达的血红蛋白。出生6个月后，HbA（α2β2）成为红细胞中主要的血红蛋白，HbF含量则低于1%。但HbF在成人时期增高性的表达可以缓解α肽链和类β肽链比例失衡的程度从而起到代偿性的作用。从本研究40例确诊为中国型Gγ+（Aγδβ）0杂合型患者的血细胞参数和血红蛋白电泳结果可知，杂合子患者的血红蛋白的值为102~154 g/L，表现较轻的贫血或无贫血。但MCV<80 fL和MCH< 27 pg均提示地贫的可能。杂合子患者的HbA2是正常的或轻微下降，而HbF值为10.6%～20.6%，分布范围比较集中。但当合并其他常见的β地贫基因突变时，表现为明显的中度或重度贫血（Hb显著降低），HbF也上升为80.8%～93.1%，这与文献报道的相类似［10-14］。所以进行血液学分析时，若红细胞指标提示为小细胞低色素性贫血，而HbF有相应程度的升高，且也未检测到中国人常见的17 种β地贫，需考虑缺失型β地贫的可能。当然这首先要与中国人常见的SEA⁃HPFH相鉴别，后者常有更高水平的HbF和很少有小细胞低色素性贫血样改变［15］。

虽然中国人群中，β地贫主要是因β珠蛋白基因的点突变所致，但李志琴等［16］的调查显示在中国南方人群分别有10%和13%的中间型地贫的基因构成为中国型Gγ+（Aγδβ）0地贫和SEA⁃HPFH，这提示这2种缺失型突变也是我国南方人群比较常见的类型。目前国内商业化的试剂盒普遍采用PCR⁃RDB的方法检测β地贫最常见的17种点突变，并未常规检测包括中国型Gγ+（Aγδβ）0在内的中国人比较常见的缺失型β地贫。β地贫的临床检验过程中，当发现基因检测的结果与血液学分析的结果不相符时，需考虑其他未在检测范围内的地贫类型的可能。图1A和B杂交膜条中的⁃28和CD17位点均无正常对照，显示为此2个位点的纯合突变。然而这与此2位点真实的纯合突变的血液学表现明显不同，包括HbF在内的数值也明显不一致。这些血液学表现与是否合并α地贫也有很大的相关性，故而常见α地贫的基因检测也必不可少。

在我国南方这些β地贫的高发区，通常先以血常规和血红蛋白电泳进行地贫的筛查，疑似病例再进行常规的基因检测，这时不能忽视包括中国型Gγ+（Aγδβ）0在内的缺失型β地贫存在的可能。这些缺失型地贫通常是大片段的缺失，断裂位点也比较明确，都可以采用Gap⁃PCR的方法来进行检测［17］。杂合缺失型β地贫的患者与常见β地中海贫血携带者结合有可能导致中重度β地贫患儿出生的可能，所以准确的孕前基因检测和产前诊断就非常有必要。总之，罕见β地贫的正确诊断和鉴别，对于遗传咨询和产前诊断可以提供更好的依据。尤其当不符合遗传规律时，更具有指导性的价值。

参考文献

［1］Panyasai S，Fucharoen S，Surapot S，et al.Molecular basis and hematologic characterization of deltabeta⁃thal⁃assemia and hereditary persistence of fetalhemoglo bin in Thailand［J］.Haematologica，2004，89（7）：777-781.

［2］徐湘民.见于中国人的HPFH和δβ⁃地中海贫血的分子基础［J］.中华医学遗传学杂志，1988，15（5）：315-317.

［3］So CC，So AC，Chan AY，et al.Detection and char⁃acterisation of beta⁃globin gene cluster deletions in Chi⁃nese using multiplex ligation⁃dependent probe amplifi⁃cation［J］.J Clin Pathol，2009，62（12）：1107-1111.

［4］Chen W，Zhang X，Shang X，et al.The molecular ba⁃sis of beta⁃thalassemia intermedia in southern China：genotypic heterogeneity and phenotypic diversity［J］. BMC Med Genet，2010，11：31.

［5］唐斌，王继成，秦丹卿，等.中国型~Gγ~＋（~Aγδβ）~0复合β⁃地中海贫血的产前诊断分析［J］.临床血液学杂志，2015，28（4）：630-632.

［6］Mann JR，MacNeish AS，Bannister D，et a1.δβ⁃thal⁃assemia in a Chinese family［J］.Brit J Haemotol，1972，23（4）：393-402.

［7］Henthorn PS，Smithies O，Mager DL，et al.Molecu⁃lar analysis of deletions in the human beta⁃globin gene cluster：deletion junctions and locations of breakpoints ［J］.Genomics，1990，6（2）：226-237.

［8］Fucharoen S，Pengjam Y，Surapot S，et al.Molecular and hematological characterization of HPFH⁃6/Indian deletion⁃inversionGγ+（Aγδβ）0andGγ+（Aγδβ）0⁃thalas⁃semia/HbE in Thai patients［J］.Am J Hematol，2002，71（2）：109-113.

［9］Xu XS，Hong X，Wang G.et al.Induction of endoge⁃nous gamma⁃globin gene expression with decoy oligo⁃nucleotide targeting Oct⁃1 transcription factor consen⁃sus sequence［J］.J Hematol Oncol，2009，2：15.

［10］杜丽，秦丹卿，王继成，等.5个家系δβ地中海贫血的家系分析及产前诊断［J］.分子诊断与治疗杂志，2015，5（1）：27-32.

［11］覃丽波，陈萍，陈文强，等.广西地区Gγ+（Aγδβ）0⁃珠蛋白生成障碍性贫血的研究［J］.实用儿科临床杂志，2012，27（3）：1151-1153.

［12］Changsri K，Akkarapathumwong V，Jamsai D，et al. Molecular mechanism of high hemoglobin F produc⁃tion in Southeast Asian⁃type hereditary persistence of fetal hemoglobin［J］.Int J Hematol，2006，83（3）：229-237.

［13］Yu X，Yang LY，Yang HT，et al.Molecular epidemi⁃ological investigation of thalassemia in the Chengdu re⁃gion，Sichuan province，southwest China［J］.Hemo⁃globin，2015，39（6）：393-397.

［14］王春芳，韦传东，雷茗，等.Gγ+（Aγδβ）0地中海贫血复合β地中海贫血家系的表型与基因型分析的警示［J］.中国儿童保健杂志，2015，23（11）：1191-1193.

［15］Bollekens JA，Forget BG.Delta beta thalassemia and hereditary persistence of fetal hemoglobin［J］.Hematol Oncol Clin North Am，1991，5（3）：399-422.

［16］李志琴，莫秋华，钟雄林，等.一个β地中海贫血复合δβ地中海贫血家系的表型与基因型分析［J］.中华医学遗传学杂志，2001，18（4）：310-313.

［17］Tritipsombut J,Phylipsen M，Viprakasit V，et al.A single⁃tube multiplex gap⁃polymerase chain reaction for the detection of eight β⁃globin gene cluster deletion⁃scommon in Southeast Asia［J］.Hemoglobin,2012，36 （6）：571-580.

基金项目：广东省科技计划项目（2014A020212246）

作者单位：广东省妇幼保健院医学遗传中心，广东，广州511442★通讯作者：何天文，E⁃mail：love830415@126.com

Genetic research and clinical analysis of deletional ChineseGγ+(Aγδβ)0⁃thalassemia

WANG Jicheng,QIN Danqing,LUO Mingyong,HE Tianwen★
(Medical Genetics Center of Guangdong Women and Children Hospital,Guangzhou,Guangdong,China,511442)

［ABSTRACT］ObjectiveToinvestigatethegenotypeandclinicalfeaturesofdeletional ChineseGγ+(Aγδβ)0⁃thalassemia.MethodsBlood cell count and hemoglobin electrophoresis analysis were performed on the blood samples of all 42 subjects.Gap⁃PCR and PCR⁃reverse dot hybridization analysis were used to detect globin gene mutations.ResultsAmong all the subjects,40 cases were identified to be heterozygote of deletional ChineseGγ+(Aγδβ)0⁃thalassemia.Hemoglobin analysis showed normal or mild anaemia.And the value of HbF was about 10.6%~20.6%.The other 2 cases were of ChineseGγ+(Aγδβ)0accompanied by other β⁃thalassemia.The value of HbF was around 80.8%～93.1%.And showed symptoms of severe anemia.ConclusionChineseGγ+(Aγδβ)0⁃thalassemia is a common type of deletional β⁃thalassemia in Chinese people.The heterozygotes have mild clinical symptoms,when co⁃inherited with other thalassemia,it will change the hematological manifestations.

[KEY WORDS]β⁃thalassemia;δβ⁃thalassemia;Gene diagnosis