亲水色谱法测定硝酸盐和亚硝酸盐方法研究

张宏伟，张立娟，郑冬梅，*（.东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨50030；.天津市食品研究所有限公司，天津30609）



亲水色谱法测定硝酸盐和亚硝酸盐方法研究

张宏伟1，张立娟2，郑冬梅1，*
（1.东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨150030；2.天津市食品研究所有限公司，天津301609）

摘要：建立使亲水色谱柱同时测定硝酸盐和亚硝酸盐的高效液相色谱方法。样品匀浆后超声提取，高速离心处理，采用亲水色谱柱分离，乙酸铵和乙腈作为流动相进行等度洗脱，210 nm紫外检测。该方法简便快捷、准确可靠，成本低廉，适用于多种蔬菜中亚硝酸盐和硝酸盐的分析。

关键词：蔬菜；硝酸盐；亚硝酸盐；亲水色谱

蔬菜中含有较多的硝酸盐，在硝酸盐还原酶作用下硝酸盐可能产生大量的亚硝酸盐，对人产生毒害作用。随着分析化学新方法和新技术的不断出现和发展，食品中亚硝酸盐的检测也更加多元化，新的检测方法层出不穷，常见方法有［1-8］：（1）光度法：包括格里斯试剂比色法、催化光度法、流动注射系统-分光光度法、顺序注射系统-分光光度法、导数光度法；（2）示波极谱法；（3）荧光法；（4）离子色谱法；（5）催化动力学法、气相色谱法以及各种传感器技术等。我国的国标方法为离子色谱法和格里斯试剂比色法［8］。这两种方法基本是肉类食品与果蔬制品中亚硝酸盐残留检测的主要方法。离子色谱可以对硝酸盐和亚硝酸盐进行同时分析，已经成为国际标准方法［9-10］，但离子色谱尚未在中国普及，而且耗材较贵，严重影响色谱法在硝酸盐和亚硝酸盐分析中应用。

本研究采用高效液相色谱法对硝酸盐和亚硝酸盐的含量进行检测，利用亲水色谱柱ZIC-HILIC作为实验的色谱柱，分别采用不同浓度的甲酸胺和醋酸铵作为流动相，紫外检测器于210 nm条件下检测亚硝酸盐的含量，通过改变不同流动相的浓度以及pH来确定最佳的方法。

1　材料与方法

1.1材料与仪器设备

水为超纯水；硝酸钾、亚硝酸钠、甲酸铵、乙酸铵、甲酸、冰乙酸：国药集团化学试剂有限公司；甲醇和乙腈：Merck。

1100高效液相色谱仪：Agilent，配紫外检测器；MIXER B-400均质仪：Buchi；KQ3200B超声波清洗仪（250 W，40 KHz）：昆山市超声波仪器有限公司；FE20 pH计：梅特勒-托利多仪器有限公司。

1.2样品前处理

使用MIXER B-400均质仪将黄瓜样品粉碎均质。准确称取匀浆5.00 g，加入80 mL纯水，40℃超声提取30 min，每隔5 min振荡1次，提取后取出放置至室温，加水稀释至刻度。溶液经滤纸过滤后，取部分溶液于10 000 r/min离心15 min，取上清液1 mL使用乙腈定容至10 mL，取定容液过0.22 μm四氟乙烯滤膜后上机检测。

1.3色谱条件

色谱柱ZIC-HILIC（MERCK）100mm×2.1mm，3.5μm，流速0.3 mL/min，柱温30℃，紫外检测器波长210 nm［3］，流动相为20 mmol/L pH=4.0乙酸铵，90%乙腈。

2　结果与讨论

2.1试样提取方法的选择

为了确定较优的亚硝酸盐和硝酸盐提取温度和时间，本试验对提取时间和温度进行优化。准确称取黄瓜匀浆5.00g，以超纯水定容到100mL，分别选用30、40、50、60℃进行超声水浴提取，超声功率250 W，频率40 KHz，提取时间为20、30、40、50 min，以60℃、50 min时亚硝酸盐提取效率为100%计算，不同时间和温度时的提取效率如图1所示。

图1　不同处理方式对亚硝酸盐提取率的影响Fig.1　Effect of treatments on the extraction rate of nitrite

如图1所示，试验结果表明，在同一个提取温度条件下随着提取时间的延长，亚硝酸盐提取率呈现先提高再下降的趋势，在40℃超声提取30 min即可获得最高的提取率，提取时间适中，因此选择40℃超声提取30 min为本研究的提取条件。

2.2流动相的优化

分别选用20 mmol/L甲酸铵，20 mmol/L乙酸铵，在其自然pH、pH=4和pH=3条件下与乙腈进行混合，混合比例为乙腈85%和90%，由于亚硝酸根较硝酸根出峰晚，本文以分离度和亚硝酸根出峰时间为判定指标进行试验。试验结果见表1和表2，最优色谱条件下标准品图见图2。

由表1和表2可知，甲酸胺流动相组分离度低于相同条件下的乙酸铵流动相组，甲酸胺流动相组亚硝酸根出峰时间长于相同条件下的乙酸铵流动相组，因此选择乙酸铵组作为流动相。相同条件下90%乙腈组较85%乙腈亚硝酸根离子出峰时间晚，硝酸根和亚硝酸根分离度大，同时硝酸根距离负吸收峰远，有助于自动积分，因此选取20 mmol/L乙酸铵，乙腈浓度为90%，pH为4时，为最快捷，高效的测定亚硝酸盐含量的方法。

表1　不同流动相对分离度的影响Table 1　The effect of Mobile phase on the resolution of peaks

表2　不同流动相对亚硝酸盐出峰时间的影响Table 2　The effect of Mobile phase on the peak-time of nitrite min

图2　标准品色谱图Fig.2　The chromatographicdetection result of standardsample

2.3方法线性试验、检出限及回收率

参照国标方法一［8］配制亚硝酸盐和硝酸盐混合标准工作溶液，采用上述色谱条件检测，以峰面积（y）对浓度（x）作图，得到工作曲线，并由基线噪音确定出检测限和定量限。其线性范围、方程及相关系数见表3。

表3　 回归方程与检测限Table 3　The correlation coefficients and LODs

由表3可知，该方法检测亚硝酸根和硝酸根具有良好的线性关系。线性相关系数外都达到0.998以上，亚硝酸根和硝酸根最低检出限分别为：0.01 mg/L和0.05 mg/L，均达到或超过国标方法一的水平。由于亚硝酸根和硝酸根在210 nm附近有较大吸收，因此紫外检测器在210 nm波长下对这两种离子具有较高的灵敏度，因此获得较国标方法更高的灵敏度。同时，紫外检测器对Cl-不灵敏，可以降低常见的Cl-的干扰［11］。

2.4精密度试验

取浓度为0.1 mg/L亚硝酸盐和硝酸盐混合标准工作溶液按上述确定的色谱条件进样6次，保持每次进样色谱条件一致。通过分析色谱图计算得出各生物胺色谱峰的平均值，通过统计分析得出标准偏差（SD）和相对标准偏差（RSD），得出结果越小说明精密度越高。精密度试验结果如表4所示。

表4　 精密度试验结果Table 4　The results of precision

由表4可知，亚硝酸根和硝酸根色谱峰面积的RSD在1.267 8%～1.734 3%范围内，说明该方法精密度良好。

2.5回收率试验

采用向样品中加标的方法进行回收率试验，试验结果如表5所示。

表5　回收率试验结果Table 5　The results of recovery rate

3　结论

经过试验确定分析方法为样品匀浆加纯水40℃超声提取30 min，使用ZIC-HILIC（MERCK）100 mm× 2.1 mm，3.5 μm色谱柱，以20 mmol pH=4.0乙酸铵和90%乙腈溶液等度洗脱，流速0.3 mL/min，柱温30℃，210 nm紫外检测，5 min内完成分析。该方法具有无需复杂前处理，不需固相萃取小柱，利用现有高效液相色谱，检测时间短，7 min内完成分析等优点，仅需购买亲水色谱柱（HILIC柱）就可以开展工作，因此具有良好的应用推广价值。

参考文献：

［1］杜红霞，霍稚非，李洪军.食品中亚硝酸盐检测技术研究进展［J］.肉类研究，2006（1）：41-45

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［3］徐霞，应兴华，段彬伍.紫外检测离子色谱法测定酱腌菜中的亚硝酸盐与硝酸盐［J］.食品与发酵工业，2007，33（3）：120-122

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［5］胡艳.几种阴离子的超分子传感及亚硝酸盐的绿色化分析方法的研究［D］.成都：四川大学，2007

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［7］王燕.化学发光法测定海水中低浓度硝酸盐和亚硝酸盐含量的方法探究及应用［D］.青岛：中国海洋大学，2009

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［10］European Committee for standardization.Foodstuffs-determination of nitrate and/or nitrite content-Part4：Ion-exchange chromatographic（IC）methodfor the determination of nitrate and nitrite content of meat products.（EN12014-4：2005）

［11］牟世芬，刘克纳，丁晓静.离子色谱方法及应用［M］.2版.北京：化学工业出版社，2005

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.11.034

作者简介：张宏伟（1982—），男（汉），实验师，硕士，研究方向：食品科学。

*通信作者

收稿日期：2015-11-12

Research of Determination of Nitrate and Nitrite by Hydrophilic Chromatography

ZHANG Hong-wei1，ZHANG Li-juan2，ZHENG Dong-mei1，*

（1.College of Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，Heilongjiang，China；2.Food Research Institute Co.，Ltd.，Tianjin 301609，China）

Abstract：The method to determination of nitrate and nitrite in vegetables was established by HILIC column. Vegetables samples were pre-treated by ultrasonic extraction and high-speed centrifugation，separated by HILIC column which used ammonium acetate and acetonitrile as the mobile phase，isocratic elution and UV detection at 210 nm.The method was simple，rapid，accurate and reliable，cheap，and suited forthe analysis of nitrite and nitrate in vegetables.

Key words：vegetables；nitrates；nitrites；HILIC