苹果中糖含量的HPLC检测条件研究

王艳，杜爱玲，周长远（.山东职业学院生物工程系，山东济南25004；2.山东大学化学与化工学院，山东济南25006；.枣庄市台儿庄区林业局，山东枣庄277400）



苹果中糖含量的HPLC检测条件研究

王艳1，杜爱玲2，*，周长远3
（1.山东职业学院生物工程系，山东济南250104；2.山东大学化学与化工学院，山东济南250061；3.枣庄市台儿庄区林业局，山东枣庄277400）

摘要：利用反相高效液相色谱法测定苹果中的糖含量，针对糖的特殊结构，调整高效液相色谱法的测试条件，获得了适于苹果中糖含量的测试方法。色谱条件：ODS柱，RI检测器，柱温25℃，进样体积10μL，流动相为3∶97的甲醇-水体系，流速1mL/min，等度洗脱。在选定的检测条件下，可分析出苹果中5种主要的糖，果糖、葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖和D-木糖；在对市场上国光、富士、红玉、黄金4种不同的苹果进行检测时发现各品种间糖成分差异不大。

关键词：苹果；糖；HPLC；分离效果

苹果是世界四大水果之一，因其爽脆可口、汁多味甜等优点而广受人们喜爱，糖是苹果的重要风味成分和营养成分，准确测定其中的糖对于研究苹果的品质和贮藏加工具有重要的意义［1］。目前化学分析［2］、比色分析［3］、纸色谱［4］、薄层色谱［5］、气相色谱［6］、高效液相色谱［7］等都用于糖的分离和测定。HPLC因其快速、简便等优点常用于糖的分析，但由于糖分子的特殊结构，目前缺少一个统一的HPLC方法来分析苹果中的糖。为了全面评价不同苹果的风味特色并保证其测定的稳定性，本文将考察不同反相高效液相色谱测试条件对分析结果的影响，获得适用于苹果中糖含量测定的分析条件并以此分析不同品种间糖含量的差异。

1　材料与方法

1.1仪器与试剂

1260Infinity高效液相色谱仪、G5611A生物惰性四元泵、G5667A自动进样器、G5664A馏分收集器：美国安捷伦公司；HWS-24电热恒温水浴锅：上海双旭电子有限公司；梅特勒AL204电子分析天平：瑞士梅特勒托利多；贝克曼L-100K超速离心机：宁波欧普仪器有限公司。

果糖、葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、D-木糖：美国Sigma公司；甲醇（色谱纯）：国药集团化学试剂有限公司；纯净水经抽滤机过滤制备。

1.2标准溶液的配制［8］

准确称取果糖、葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、D-木糖各50 mg，用蒸馏水稀释定容至25 mL的容量瓶中。

分别吸取上述标准溶液各1 mL，混合均匀，备用。

1.3苹果样品的处理

准确称取一定量的果肉，研磨后加水在恒温水浴锅内搅拌30 min，离心过滤，收集上清液并用0.45 μm的微孔滤膜过滤，待测。

1.4糖的测定

高效液相色谱法是以液体作为流动相的现代柱色谱分离分析方法，在技术上采用高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器实现分析速度快、分离效率高和操作自动化。综合考虑柱效、分离度以及糖的结构特点，我们选择化学键合的C18烷基柱为固定相，示差折光检测器，流速1 mL/min，等度洗脱。

测定过程中通过改变流动相、柱温、进样量和进样时间，用同一标准样品进样，考察其峰面积和分离度等，对比不同条件下的分离效果，确定较优的检测条件。

色谱峰分离度可以通过下式进行计算：

式中：RW表示分离度；d表示峰间距；tR1、tR2分别表示色谱峰1、色谱峰2的保留时间；yW1、yW2分别表示色谱峰1、色谱峰2的峰宽。

2　结果与讨论

2.1流动相的选择

根据反相键合色谱对流动相的要求及糖分子含有极性基团的结构特点，并考虑试验试剂的安全性等因素，我们选用甲醇-水体系作为流动相。

调整流动相中甲醇的体积百分数分别为1%、3% 和5%，其他条件为：柱温为25℃、进样量15 μL。考察不同配比的流动相对各糖含量和分离度的影响，分离效果见图1和表1、表2。

图1　 不同流动相配比的HPLC色谱图Fig.1　HPLC chromatograms with different mobile phase composition

表1　不同流动相配比对各糖间的分离度Table 1　The resolution between the different sugars with different mobile phase composition

表2　不同流动相配比各糖的相对含量Table 2　The relative content of different sugars with different mobile phase composition

由图1、表1、表2可知，甲醇在流动相中的比例增大，有利于各组分的分离，可有效改善峰形，但是随着甲醇含量的增加，苹果中的主要糖分之一葡萄糖的峰信号较弱，同时基线噪声增大，分析灵敏度降低；当增加水的比例时，葡萄糖峰信号增强，但此时果糖和阿拉伯糖峰距小，分离度低。综合考虑分离效果和峰信号强弱，确定流动相为甲醇体积分数为3%的甲醇-水体系。

2.2柱温的影响

控制柱温分别为15、25、35℃，流动相为V甲醇∶V水= 3∶97，其他条件同2.1。考察各糖在此条件下的含量和分离度的变化。分离结果见图2、表3、和表4。

柱温是一个重要的色谱操作参数，它直接影响分离效能和分析速度。降低柱温色谱柱的选择性增大，各糖之间的分离度较高，但是此时葡萄糖的信号响应值减小，检出限较高，检测灵敏度大大降低；升高柱温有利于提高柱效能，缩短分析时间，但是此时果糖、阿拉伯糖和D-木糖大量分解转化，导致检测失败。兼顾分离效果和检测灵敏度，确定柱温箱温度25℃。

图2　不同柱温时的HPLC色谱图Fig.2　HPLC chromatograms with different column temperature

表3　不同柱温各糖间的分离度Table 3　The resolution between different sugars with different column temperature

表4　 不同柱温时各糖的相对含量Table 4　The relative content of different sugars with different column temperature

2.3进样量

分别调整进样量为5、10、20 μL，柱温25℃，其他条件同2.2。分析混合糖在此条件下的含量分布和分离度的变化。测定结果见图3、表5和表6。

图3　 不同进样量时的HPLC色谱图Fig.3　HPLC chromatograms with different injection volume

表5　不同进样量时各糖间的分离度Table 5　The resolution between different sugars with different injection volume

表6　不同进样量时各糖的相对含量Table 6　The relative content of different sugars with different injection volume

进样量与柱容量和检测器的线性范围等因素有关，进样量太小，基线噪声增大，检测器灵敏度降低，检测器不易检测到阿拉伯糖、木糖和葡萄糖，导致分析误差增大；进样量太大，基线噪声较小，但是柱效能下降，使得果糖和阿拉伯糖未能分开，同时D-木糖出峰失败。在实际的分析中最大允许进样量应控制在使半峰宽基本不变，而峰高与进样量成线性关系的范围内，因此我们确定进样量为10 μL。

2.4不同品种苹果中糖的HPLC分析

根据以上分析确定苹果中糖的检测条件如下：化学键合C18烷基柱为固定相，示差折光检测器，流动相为V甲醇∶V水=3∶97，等度洗脱，流速1 mL/min，柱温25℃，进样量10 μL。在此检测条件下进行市购不同品种苹果糖分的测定，最终所得的色谱图如图4，分离度和归一化含量见表7、表8。

图4　不同品种苹果的HPLC色谱图Fig.4　HPLC chromatograms of different apple cultivars

表7　不同品种苹果各糖间的分离度Table 7　The resolution between different sugars of different apple cultivars

表8　不同品种苹果各糖的相对含量Table 8　The relative content of different sugars with different apple cultivars

结果表明，该检测条件重现性较好，不同品种苹果间各糖的含量相差不大。

3　结论

糖是苹果的重要风味成分和营养成分，由于糖分子的特殊结构及高效液相色谱法的优点，我们选用化学键合的C18烷基柱，示差折光检测器，柱温25℃，进样量10 μL，体积比为3∶97的甲醇-水体系为流动相，等度洗脱，流速1 mL/min，进行苹果中糖成分的测定，在选定的检测条件下可以检测出其中的5种糖，此方法简便可靠，灵敏度高，重现性较好。同时对市场上4种不同品种的苹果进行糖成分检测，结果发现各苹果间糖含量差异不大。

参考文献：

［1］王常糯.天然果汁的分析现状［J］.云南大学学报，1999，21（52）：110-111

［2］黄洁，宋纪蓉，史红兵，等.苹果发酵液中残余还原糖的测定方法比较［J］.工业微生物，2001，31（3）：38-40

［3］杜凤春，伞淑文.比色法测糖与快速测糖仪测糖的对比［J］.黑龙江纺织，1994（1）：31

［4］谈燮峰，曾丽仙.用纸色谱方法分离鉴定琼枝和沙菜多糖水解物［J］.化学通讯，1986（2）：58-61

［5］尤娅利，阮征，印遇龙.薄层色谱-蒽酮比色法定量测定低聚乳果糖含量［J］.安徽农业科学，2009，37（5）：1883-1885

［6］周欣，王庆彪，刘拐钧.气相色谱法检测葡萄糖、麦芽糖、果糖和蔗糖［J］.海峡药学，2001，13（4）：48-49

［7］李敬慈.高效液相色谱法测糖［J］.河北大学学报（自然科学版），1997（4）：87-90

［8］王艳颖，胡文忠，庞坤，等.高效液相色谱-蒸发光散射法测定苹果中可溶性糖的含量［J］.食品与发酵工业，2008，34（6）：129-131

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.11.028

基金项目：科技部农业科技成果转化项目（2008GB2C600178）

作者简介：王艳（1986—），女（汉），硕士，主要研究方向：天然产物有效成分的分离。

*通信作者：杜爱玲（1956—），女（汉），教授，硕士，研究方向：天然产物有效成分的提取分离，以及材料腐蚀与防护。

收稿日期：2015-04-28

A Conditional Study of Analyzing Sugars in Apple With High Performance Liquid Chromatography

WANG Yan1，DU Ai-ling2，*，ZHOU Chang-yuan3

（1.Department of Bioengineering，Shandong Polytechnic，Jinan 250104，Shandong，China；2.School of Chemistry and Chemical Engineering，Shandong University，Jinan 250061，Shandong，China；3.Tai'erzhuang Forestry Bureau of Zaozhuang Municipal，Zaozhuang 277400，Shandong，China）

Abstract：Reversed-phase high performance liquid chromatography was used to analyze sugars in apples，in light of the characteristics of sugars，the adjusted high performance liquid chromatography technique was employed to analyze sugars.The chromatographic conditions：octadecylsilyl column，refractive index detector，column temperature at 25℃，injection volume was 10 μL，a mobile phase was Vmethanol∶Vwater=3∶97，flowing rate was 1 mL/min，isocratic elution.Five main sugars in apples were detected under the selected conditions：fructose，glucose，sucrose，arabinose and D-xylose；sugar compositions were found little difference among the varieties of Guoguang，Fushi，Hongyu and Huangjin bought on the market.

Key words：apple；sugar；HPLC；separation effect