RP-HPLC法同时测定天黄颗粒中阿魏酸和姜黄素的含量

谭敏秀，何锦钧，关杏英，周　清，任燕芬

(1.佛山市中医院，佛山　528000；2.广东药学院，广州　510006)



RP-HPLC法同时测定天黄颗粒中阿魏酸和姜黄素的含量

谭敏秀1，何锦钧1，关杏英1，周清2*，任燕芬1

(1.佛山市中医院，佛山528000；2.广东药学院，广州510006)

摘要：目的建立同时测定天黄颗粒中阿魏酸和姜黄素含量的方法。方法采用反相高效液相色谱法。色谱柱为Diamond-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈-1 mL·L-1磷酸水溶液(二元梯度洗脱)；流速为0.8 mL·min-1；检测波长为354 nm；柱温约为20 ℃。结果阿魏酸和姜黄素质量浓度分别在7～148和20～200 μg·mL-1范围内与各自峰面积线性关系良好，平均回收率分别为108.4%和103.7%,RSD值分别为1.9%和1.2%。样品中阿魏酸和姜黄素平均含量分别为0.4和1.27 mg·g-1。结论该方法精密度好，结果准确，可用于天黄颗粒中阿魏酸和姜黄素的含量测定。

关键词：天黄颗粒；阿魏酸；姜黄素；反相高效液相色谱法；含量测定

天黄颗粒是医院在制剂天柏金黄散基础上开发的颗粒剂型外用药，由黄柏、姜黄、当归和大黄等多味药材制成，具有凉血、活血、化瘀、止痛的功效。在处方中，当归味辛，有活血化瘀、去肿止痛的作用；姜黄味辛，泄苦通温，为血中气药，古今医家视之为风湿肩臂疼痛的要药。为了更好地控制制剂的质量，本实验以该方中主要有效成分阿魏酸和姜黄素为指标，拟建立1种简便可靠的含量测定方法。经查阅，同时对天黄颗粒中阿魏酸[1-6]和姜黄素[7-11]进行含量测定未见文献报道，本方法分离效果好，定量准确，专属性较强。

1仪器与试药

1.1仪器高效液相色谱仪(LC-10ATvp plus，UV检测器，日本岛津公司)；LC Solution色谱工作站。

1.2试药对照品：阿魏酸(批号0773-9910)、姜黄素(批号110823-200603)，购自中国药品生物制品检定研究院；天黄颗粒(批号141101-141103)，由佛山市中医院提供。甲醇、乙腈均为色谱纯；其他试剂均为分析纯；实验用水为屈臣氏蒸馏水。

2方法与结果

2.1样品液制备

2.1.1对照品溶液的制备准确称取阿魏酸对照品14.8 mg、姜黄素对照品20.0 mg，分别置于100 mL量瓶中，加700 mL· L-1甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得到质量浓度分别为148和200 μg·mL1的阿魏酸和姜黄素对照品储备液。

2.1.2供试品溶液的制备称取2 g天黄颗粒，加入700 mL· L-1的甲醇30 mL，加热回流处理30 min，滤过，收集滤液，再用0.45 μm的滤膜过滤，得供试品溶液。

2.1.3阴性对照溶液的制备按照处方组成，取除当归、姜黄外的其余药味，按照工艺要求制成不含当归和姜黄的天黄颗粒；按照2.1.2项下操作方法制成阴性对照溶液。

2.2色谱条件与系统适用性实验Diamond-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，迪马公司)为色谱柱；乙腈-1 mL·L-1磷酸水溶液(二元梯度洗脱，洗脱程序见表1)为流动相；流速为0.8 mL·min1；检测波长为354 nm；柱温为室温(约20 ℃)。分别取对照品、供试品、阴性对照溶液20 μL注入液相色谱仪，依法测定；以阿魏酸或姜黄素计算理论板数均不低于5 000；阿魏酸和姜黄素峰的拖尾因子分别为0.91和0.97；保留时间分别约为15.7和31.1 min；与相邻未知峰的分离度均大于1.5；阴性对照无干扰，见图1。

图1HPLC图

A.对照品； B.样品；C.阴性；1.阿魏酸；2.姜黄素

Fig.1 HPLC chromatograms

A.reference substance；B.sample；C.negative；1.ferulic acid；2.curcumin

表1流动相梯度洗脱程序

Tab.1 The gradient elution programs of mobile phase

时间/min乙腈/%1mL·L-1磷酸/%0～15 20→50 80→5015～30 50→100 50→0>301000

2.3方法学考察

2.3.1标准曲线与线性范围分别精密吸取2.1.1项下的阿魏酸和姜黄素储备液，加700 mL·L-1的甲醇稀释成不同质量浓度的阿魏酸(质量浓度分别为7，14，21，28，35，70和148 μg·mL1)、姜黄素(质量浓度分别为20，40，60，80，120，160和200 μg·mL1)溶液，依次进样(进样量20 μL)。以溶液质量浓度为横坐标，峰面积均值为纵坐标，绘制阿魏酸和姜黄素标准曲线。得阿魏酸的回归方程Y=43 181X+20 201(r=0.999 4)，姜黄素的回归方程Y=35 416X-161 847(r=0.999 3)。表明阿魏酸质量浓度在7～148μg·mL1之间、姜黄素质量浓度在20～200 μg·mL1之间与峰面积呈良好线性关系。

2.3.2精密度实验取质量浓度为21 μg·mL1的阿魏酸和80 μg·mL1的姜黄素对照品混合溶液连续测定6次，记录峰面积。阿魏酸和姜黄素峰面积的RSD值分别为0.41%和0.33%，表明仪器的精密度良好。2.3.3稳定性实验取供试品溶液(批号141101)，分别在0，2，4，6，8和12 h进样，记录峰面积，阿魏酸和姜黄素峰面积的RSD值分别为0.71%和0.41%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.3.4重复性实验取供试品溶液(批号141101)6份，按照2.1和2.2项下所述方法处理、测定，结果阿魏酸平均质量浓度为27.32 mg·mL1、姜黄素平均质量浓度为84.71 mg·mL1，RSD值分别为0.98%和0.41%，表明分析方法的重复性良好。

2.3.5加样回收实验称取同一批号样品(批号141101)9份，每份2 g，按照2.1项下所述方法处理，取适量已知含量的供试品，每3份中分别加入约80%，100%和120%的阿魏酸和姜黄素混合对照品溶液，按照2.2项下所述方法进行测定，计算回收率，见表2，阿魏酸的平均回收率为108.4%，RSD值为1.9%；姜黄素的平均回收率为103.7%，RSD值为1.2%。结果表明，本方法准确可靠。

表2回收率实验结果

Tab.2 Results of the recovery test

阿魏酸样品含量/μg·mL-1加入量/μg·mL-1平均检出量(n=3)/μg·mL-1平均回收率/%(n=9)RSD/%(n=9)姜黄素样品含量/μg·mL-1加入量/μg·mL-1平均检出量(n=3)/μg·mL-1平均回收率/%(n=9)RSD/%(n=9)27.3222.5051.19108.41.984.7167.50153.86103.71.227.3227.5056.7284.7185.00172.1027.3235.0065.9284.71100.00190.06

2.4样品测定取天黄颗粒样品3批，按照2.1项下方法制备样品溶液，按照2.2项下所述方法进行测定，计算得出样品中阿魏酸和姜黄素的平均含量分别为0.40和1.27 mg·g-1。

3讨论

阿魏酸易溶于热水、乙醇和乙酸乙酯，稍溶于乙醚，难溶于苯和石油醚；因此常采用醇-水混合溶剂提取，提取方式常采用回流、超声等；姜黄素不溶于水，溶于醇类溶剂。因此在提取分离条件的摸索过程中，采用醇-水混合溶剂提取，比较了超声和回流2种不同的提取方式，并比较了提取时间、溶剂量和溶剂比率对提取率的影响。结果表明，15倍(质量比)的混合溶剂(体积分数70%甲醇-水)回流提取30 min，离心，过滤后制得的样品溶液，阿魏酸和姜黄素的提取率均较高。

阿魏酸具有一定的弱酸性，且出峰时间较短，存在峰形拖尾的现象，因此在流动相中加酸后色谱峰峰形明显改善，分离度也大大提高。文献报道[2-6],阿魏酸含量测定流动相体系较多，如乙腈-磷酸水、甲醇-醋酸水、乙腈-水、甲醇-水、乙腈-甲醇等，本文也选用了这几种流动相分别进行考察，发现选用乙腈-1mL·L-1磷酸水溶液(梯度洗脱)为流动相效果最好，故采用了表1的流动相体系及梯度变换方式。

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基金项目：广东省医学科研基金项目(编号:B2014212)；2014年佛山市医学类科技攻关项目(编号:2014AB00341)

作者简介：谭敏秀，女，副主任药师

*通信作者：周清，男，讲师

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.04.014

中图分类号：R927.2

文献标志码：A

文章编号：1004-2407(2016)04-0374-03

(收稿日期：2015-09-15)

Simultaneous determination of ferulic acid and curcumin in Tianhuang Granules by RP-HPLC

TAN Minxiu1，HE Jinjun1，GUAN Xingying1，ZHOU Qing2*，REN Yanfen1

(1.Foshan Hospital of Traditional Chinese Medicine，Foshan 528000，China；2.Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China)

Abstract:Objective To establish a determination method for ferulic acid and curcumin in Tianhuang Granules.Methods An RP-HPLC method was established.The chromatographic column was Diamond-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm).The mobile phase was a mixture of acetonitrile-1 mL·L-1phosphoric acid (gradient elution).The flow rate was 0.8 mL·min-1,the UV detection wavelength was 354 nm，and the column temperature was 20 ℃.Results The linear range of ferulic acid was between 7-148 μg·mL-1with a good linear relationship and the average recovery was 108.4%，RSD was 1.9%.The linear range of curcumin was between 20-200 μg·mL-1with a good linear relationship and the average recovery was 103.7%，RSD was 1.2%. The average contents of ferulic acid and curcumin were 0.4 and 1.27 mg·g-1,respectively.Conclusion The method is accurate with high precision， and can be used for the quantitative determination of Tianhuang Granules.

Key words：Tianhuang Ganules；ferulic acid；curcumin；RP-HPLC；assay