星点设计—效应面法优化姜黄素提取工艺

谢顺岚　吴方建

[摘要] 目的 优选姜黄素提取工艺。 方法 以超声波法提取，在乙腈∶0.5%冰醋酸=50∶50，流速1.0 mL/min，柱温35℃，检测波长422 nm的高效液相色谱条件下测量姜黄素含量，再应用星点设计-效应面法对工艺进行考察。结果 最优提取工艺：乙醇浓度70.89%、提取时间49.87 min、液固比15.07∶1，此条件下姜黄素最高得率为3.732%，实际值与理论值RSD为0.53%。 结论 该优选工艺预测性良好，能够为姜黄素进一步的开发利用提供试验基础。

[关键词] 姜黄素；星点设计；高效液相色谱法；提取工艺

[中图分类号] R284.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）11（c）-0125-04

Optimization of extraction progress for curcumin by Central Composite Design-Response Surface Methodology

XIE Shunlan WU Fangjian▲

Department of Pharmacy， Yangtze River Shipping General Hospital， Hubei Province， Wuhan 430010， China

[Abstract] Objective To optimize extraction process for curcumin. Methods After exteracted by ultrasound-assisted extraction， the content of curcumin was measured by HPLC with acetonitrile： 0.5% glacial acetic acid = 50∶50， the flow rate was 1.0 mL/min， the column temperature was 35℃ and the detection wavelength was 422 nm. The process was then investigated by Central Composite Design-Response Surface Methodology. Results On the condition of 70.89% ethanol concentration， 15.07：01 fold solvent， 49.87 min each time， the highest yield was 3.732%，the RSD between observed and predicted values was 0.53%. Conclusion The curcumin optimum model can be basis for the further development and utilization with it high predictability.

[Key words] Curcumin ； Central composition design ； HPLC； Extraction progress

姜科植物姜黃（Curcuma longa L.），为多年生宿根草本植物，其根茎发达，成丛，多分支；根粗壮，末端膨大呈块根。姜黄有特异气香，性燥温，味苦、辛，具有破血行气、通经止痛、祛风痹痛的作用[1]。其主要有效成分姜黄素是国际公认的天然色素和香料[2]。研究表明，姜黄素具有广谱药理学活性，如神经保护、抗癌[3]、抗氧化[4-6]、抗菌、抗炎[7]、抗病毒，对心脑血管疾病、自身免疫病[8]、呼吸系统疾病、糖尿病、风湿[9]、肝脏疾病[10]都有治疗作用，且安全性好。临床实验发现，即使连续3个月每日口服姜黄素12 g，个体耐受性依然良好[11]。

纯净的姜黄色素为橙黄色结晶粉末，不溶于水，易溶于有机溶剂，对光敏感[12]，不耐热，易降解，碱性条件下易分解[13]。本文基于姜黄素的理化特性采用超声波辅助提取法进行提取。超声波是一种弹性机械振动波，它破坏药材细胞，使溶剂更易扩散到细胞中，从而加速了药材活性成分的溶解[14]，提高了活性成分浸出率。星点设计是效应曲面中最常见的二阶设计[15]，由二水平析因设计加轴点和中心点构成，是一种新型实验设计方法，在药学领域的应用已比较成熟，具有精度高、预测性好等特点[16]。本文应用星点设计-效应面法优选提取工艺，旨在为姜黄素成分的提取优化提供参考。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

SK5200H型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司），CPA225D型分析天平（Sartorius公司），TYS-100型高速多功能粉碎机（浙江省永康市红太阳机电有限公司），台式离心机（武汉赤城生物技术有限公司），SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司），岛津SPD-20A液相色谱仪（日本岛津公司），Agilent TC-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）（美国Agilent公司），L6C-1025M柱温箱（荆州市津海化工科技有限公司）。

1.2 试剂

姜黄饮片（湖北金贵中药饮片有限公司，产地广东，生产批号：130202），姜黄素对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110823-201004），甲醇、乙腈（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司），其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 姜黄素含量的测定

2.1.1 色谱条件

Agilent TC-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相组分A：乙腈；B：0.5%冰醋酸；A∶B=50∶50；柱温为35℃；流速为1.0 mL/min，检测波长为422 nm，进样量20 μL。在此条件下，姜黄素对照品以及姜黄素供试品的色谱图见图1。

2.1.2 对照品溶液的制备

精密称取姜黄素对照品5.0 mg，置于25 mL棕色容量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得到姜黄素对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备

取姜黄饮片，50℃烘箱干燥，粉碎机粉碎后过40目筛（直径≤0.45 mm）。准确称取姜黄粉末200 mg，加入70%乙醇3 mL，超声50 min，重复提取3次，合并提取液，离心分离取上清液。吸取0.5 mL滤液，用甲醇定容至5 mL棕色容量瓶混匀，得到供试品溶液。

2.1.4 标准曲线的绘制

精密吸取姜黄素对照品溶液0.5、1、2、3、4、5 mL，置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度混匀。取20 μL溶液过0.22 μm滤膜后按“2.1.1”中色谱条件进样3次，记录峰面积。以姜黄素对照品溶液浓度（C，μg/mL）为横坐标x，平均峰面积（A）为纵坐标y标绘制姜黄素标准曲线，线性回归方程为y=186 347x-41 625，相关系数r=0.9998，在0.56～7.28 μg/mL浓度范围内，峰面积与浓度线性关系良好。

2.1.5 方法学考察

2.1.5.1 精密度试验 精密吸取对照品溶液20 μL连续进样10次，姜黄素峰面积RSD为1.18%，表明试验仪器精密度良好。

2.1.5.2 稳定性试验 取同一供试品溶液，置于室温环境中，分别于0、1、2、4、6、8、12 h进样测定，计算得到姜黄素峰面积RSD为0.72%，说明该供试品在12 h内稳定。

2.1.5.3 重复性试验 取同一供试品溶液6份，按照“2.1.1”中的色谱条件进样，结果姜黄素峰面积RSD为1.25%，说明该试验方法重复性良好。

2.1.5.4 加样回收率试验 精密量取已知姜黄素含量的提取液6份，分别加入姜黄素对照品溶液，混匀后按照“2.1.1”中色谱条件进样测定，加样回收率=（测得量-样品含量）/加入量，具体结果见表1。

2.2 星点设计实验

2.2.1 实验设计与结果

根据预实验结果确定考察因素为乙醇浓度（A）、时间（B）、液固比（C），采用Design-Expert软件的星点设计模块设计出三因素五水平的实验方案，因素设计见表2。精密称取姜黄粉末200 mg，按照表1的条件进行3次平行实验，提取率%=（A为吸光度，a、b为标准曲线参数，V为滤液总体积、F为稀释倍数、M为姜黄粉末质量），姜黄素的提取率见表3。

2.2.2 模型建立及方差分析

采用Design-Expert 8.0软件对实验数据进行二次多元回归拟合得到回归方程：Y=3.64-0.079A+0.063B+0.022C+2.204A×10-3-0.02AC-0.035BC-0.05A2-3.64B2×10-3-0.072C2，对该方程进行方差分析及显著性检验，结果见表4。

方差分析中，回归模型的P < 0.01，R2=0.9769，表明该模型有较高的可信度；失拟项F=0.96，P=0.5173，失拟项不显著，表明该模型能够较好且误差较小地反映响应值的变化。显著性检验中，三种因素A、B、C对姜黄素的得率都有极显著影响（P < 0.01）；各因素交互作用中B、C项对实验结果有极显著影响（P < 0.01），A、C项有显著影响（P < 0.05），A、B项对试验结果无显著性影响。

2.2.3响应曲面分析及参数优化验证

采用Design-Expert 8.0绘制提取液中姜黄素含量的響应曲面图，如图2～4。响应曲面图可以分析提取条件的交互作用、确定最佳工艺，通过软件中优化（optimizion）模块对参数进行优化得到最优值。回归模型预测姜黄素最高的得率为3.732%，这时的乙醇浓度为70.89%，提取时间为49.87 min，液固比为15.07∶1。按照最优参数进行验证实验，为方便操作令乙醇浓度为70%，超声时间为50 min，液固比为15∶1。5次平行实验总姜黄素得率实测平均值为3.715%，标准偏差RSD为0.53%，表明实际值与理论预测值基本吻合，星点设计-响应面优化法得到的提取参数准确可靠，该模型具有良好的预测性。

3讨论

姜黄素的提取易受多种因素的影响，例如提取时间、提取温度和溶液组成等，如何达到最佳提取条件，尽可能提高得率，是研究者们关心的问题。目前对姜黄素的工艺优选主要为正交设计和均匀设计[17-18]，然而当因素水平较多时会产生极大工作量，且存在精确度不高、预测性不好等缺点。星点设计是效应面优化法的一种，它集数学和统计学为一体，是多因素五水平的实验设计，具有试验次数少，试验精度高等特点，在药学应用上成果显著[19]。需要注意的是，为避免由考察区域距离最优区域过远而造成最佳工艺的偏差[20]，星点设计各因素水平的选取范围及最优中心点的确定应建立在前期的单因素实验基础上。

经过最初的单因素考察，优选出姜黄素提取中的影响因素及范围，本试验优点在于能够充分考虑各因素之间的交互作用。数据模型采取二次多项式进行拟合，二项式模型的拟合相关系数高，5次平行试验平均值与最优条件下理论值基本吻合，说明该模型的可信度和预测性良好，能够对姜黄素的提取进行较为准确的分析和预测，从而为提取工艺的优选和进一步实际应用提供参考依据。

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（收稿日期：2016-08-05 本文编辑：王红双）