单克隆抗体药物生产车间（抛弃型设备）工程设计探讨

宋弘

（汇智工程科技有限公司武汉分公司，武汉 430000）



单克隆抗体药物生产车间（抛弃型设备）工程设计探讨

宋弘

（汇智工程科技有限公司武汉分公司，武汉 430000）

摘 要现阶段，国内企业（含外企）单克隆抗体（以下简称“单抗”）药物生产设备主要有传统型生产设备和一次性抛弃型生产设备两种。通过项目设计实例，结合中国GMP（2010修订版）的要求，就一次性抛弃型生产设备的车间布局设计进行探讨与分析。

关键词单抗；抛弃型动物细胞生物反应器；生产车间；工程设计；GMP

1975年，国外学者发现将小白鼠骨髓瘤细胞与绵羊红细胞免疫的小白鼠脾细胞相互融合，所形成的杂交瘤细胞组织中，产生抗体的同时，又可自行无性繁殖，从此开始了单抗技术的研究[3]。21世纪的今天，单抗已成功应用于治疗自身免疫性疾病和肿瘤等疾病中，成为继疫苗和重组蛋白后最重要的一类生物制剂。

随着中国改革开放后综合实力的不断增强，在国家《“十二五”生物技术发展规划》的推动下，国内外单抗药物研究者的不懈努力下，国内众多研究成果步入工业化进程，如何设计符合GMP的单抗药物生产线已成为医药工程设计领域的当务之急。

1 单抗的生产工艺流程及特点

单克隆抗体制备工艺流程可大致分为四个阶段：第一阶段为上游工作细胞的复苏、培养扩增；第二阶段为中游培养产物的粗纯分离；第三阶段为下游粗纯产物的精纯分装；第四阶段为单抗药物制剂生产。

1.1 上游工作细胞的复苏、培养扩增

该阶段从工作细胞的复苏开始，接种到摇瓶中恒温条件下进行细胞扩增，经历多级种子罐的的稳定扩增后，进入动物细胞生物反应器进行大量的细胞培养，细胞在扩增阶段生长并形成产物，目标产物分泌到细胞培养上清液中。待细胞培养和产物的形成完毕后，整个培养物（细胞和产物的混合物）将经过深层过滤，细胞将截留在深层过滤器中。分离后的产物仍留在澄清后的上清液中，含目标产物的细胞培养上清液暂时贮存于温度可控制的一次性储存容器中。

该生产过程生产周期长（以1 000 L细胞培养为例，从工作细胞的复苏开始，经过扩增、培养，至目标产物收获，整个过程须45～50天）、生产过程温湿度控制严格（单抗的本质是糖基化蛋白质，生产过程中对温度有严格的控制要求）。该阶段以哺乳动物细胞作为表达载体，工作细胞中带入病毒会影响到成品的质量、危害病人，也可能对生产操作人员产生危害。故在生产过程中还须有完整的病毒防范措施。

1.2 中游培养产物的粗纯分离

上游收获的培养液过滤后，首先进行Protein A的高效捕获亲和层析，去除大部分的杂质蛋白；经低pH孵育，以灭活极小概率可能存在的病毒颗粒。过滤后经阴阳离子交换后疏水层析、纳滤，以去除极小概率可能存在的病毒颗粒。该生产过程须有严格的温湿度控制和较为完整的病毒防范措施。

1.3 下游粗纯产物的精纯分装

粗纯产物溶液经过切线流过滤超浓缩和缓冲液交换后，再按要求加入所需赋型剂和蛋白稳定剂后，将原液进行分散包装（以匹配制剂生产用量）进行贮存。该生产过程须有严格的温湿度控制，病毒及其他活性物质已在中游阶段完全截留，此阶段认为是相对洁净的阶段。

1.4 单抗药物制剂的分装生产

单抗药物制剂的形式一般为非最终灭菌的无菌制剂，主要为预充针、小水针和冻干粉针[1]。该阶段生产结束后送至车间成品库冷藏。该生产过程须有严格的无菌环境和温湿度控制。制剂区域在设计中为单独一块生产区域，在制剂配液前，原液须冷库冷藏，中间检验合格后方可运至制剂区进行后续制剂工段的生产。

2 抛弃型设备在单抗生产中的特点

由于单抗生产由接种-培养-分离-制备等全过程必须是无菌操作过程，其无菌培养是产品质量的关键，因此要求包括动物细胞反应器与所有连接介质流体管道阀门、容器具、原件具有高度清洁严密完整性、易清洗、消毒、灭菌等特殊条件，这些设备常见有不锈钢材料固定型和特殊塑料软体一次性使用型（即抛弃型），下文仅讨论使用抛弃型动物细胞反应器的单抗生产线设计。

一次性抛弃型设备，是指所有与细胞培养过程物料有直接接触的部分均为一次性产品，包括接种使用的容器、扩增使用的wave袋、培养使用的培养袋等均为一次性产品。下面对培养设备展开描述。

此类细胞培养设备是由美国引进的软袋形式的动物细胞生物反应器，其中用于细胞扩增为波浪式的，用于细胞规模培养为500～2 000L搅拌式。图1 是2 000 L培养器的主体，一次性培养袋袋体自带与外界对接的接口（对接口详见图2）、袋内自带搅拌，置于可开启门的不锈钢容器中。不锈钢容器下带有滚轮，在不使用时，可推至功能间停放，不影响其他设备的运转；容器上设有可观察培养袋内情况的视孔和培养袋与外界接触的接口（详见图3），便于工作人员随时观察袋内培养情况和进料、出料时的无菌对接。一次性培养袋与其他一次性用品的对接由无菌焊接机进行无菌对接完成。在用传统设备生产单抗产品时，与物料有接触的设备均需清洗和灭活，设备的清洗和灭活也是单抗生产过程中的瓶颈之一[2]。使用一次性抛弃型设备生产单抗，所有与物料有直接接触的部分均为一次性产品，使用完成后集中通过高温灭活等处理方式处理后，扎袋外运，很好地解决了传统生产设备清洗和灭活的问题。

图1 培养器主体设备Fig.1 Main equipment figure of the incubator

图2 一次性培养袋上的无菌接口Fig.2 Sterile interface of the one-time cultivating bag

图3 正常生产时无菌对接处Fig.3 Detail of sterile interface during normal production

GMP（2010修订版）在“厂房与设施”一章中第一条（原文第三十八条）即规定：“厂房的选址、设计、布局、建造、改造和维护必须符合药品生产要求，应当能够最大限度地避免污染、交叉污染、混淆和差错，便于清洁、操作和维护”[4]。采用一次性抛弃型设备进行生产时，从工作细胞的复苏一直到制剂阶段的配料、除菌过滤，在整个生产过程中，与物料有直接接触的部分均采用一次性用品，整个工艺生产过程，均在封闭的系统中进行，管道的连接也是采用无菌焊接机进行无菌对接。在整个生产过程中，很好地避免了污染、交叉污染、混淆和差错；所有一次性用品在使用结束后通过高温灭活等处理方式处理后，扎袋外运，交由有资质单位处理，与传统方式相比，省去了大量的设备清洗时间和空间，操作、维护也相对简便。这也使得在车间布局中，更容易做到人、物流分开、不交叉，工艺路线顺畅、物流路线短捷、不返流、不迂回。同时，根据GMP（2010修订版）在生物制品（附录3）的“厂房与设备”一章中第二十条规定：“使用密闭系统进行生物发酵的可以在同一区域同时生产，如单克隆抗体和重组DNA制品”[4]。采用一次性抛弃型设备进行生产时，两条以上的生物发酵线可在同一培养发酵区域内同时生产，也减小了因房间过多隔断导致功能间利用率低的问题。

3 单抗的生产车间布局

单抗的生产，上游和中游需在D级洁净环境中进行，下游需在C级洁净环境在进行，所有物料有裸露的环节需在A级层流保护下操作，如上游的工作细胞接种、培养液的深层过滤收获、中游的收获液层析、下游的原液分装工段，均需在A级层流保护下操作。下面列举两个设计中的例子，来介绍两种完全不同的符合GMP（2010修订版）及其他设计规范、标准的生产车间布局设计案例。

3.1 上、中、下游三个阶段气锁隔断，单向人、物流设计

在单向人、物流设计中，人员进出车间的通道、洁净物料与不洁净物料转运通道、洁净器具与使用过的不洁净器具流通通道、洁净清洁工具与使用过的不洁净清洁工具流通通道均严格分开，以避免人员、物料、器具、清洁工具等退出时对供应端区域造成污染。人员、物料、器具、清洁工具等流动方向均利用门禁系统控制，当人员、物料、器具、清洁工具等进入退出区域时，门禁系统将不允许这些区域的人或物返回到供应端区域。工作人员只能由退出通道，通过专设的人流退出通道消毒后退出；物只能由退出通道，通过消毒、灭活失活后进入待清理区域。图4为某公司单抗车间的布局。

车间为单向人、物流设计，上游阶段在接种间和细胞培养间完成，中游在纯化处理（粗纯）间完成，下游在纯化处理（精纯分装）间完成，各功能间进入前均设置缓冲间，与供应走廊及其他功能间之间进行良好的气锁隔断，以最大限度地避免上、中、下游之间交叉污染。培养基的配制是为工作细胞的扩增、培养提供培养基，故两个培养基配制功能间分别靠近两条生产线的上游区域；缓冲液的配制是为中游和下游的纯化提供缓冲液（大量缓冲液在粗纯阶段使用），故缓冲液配制功能间靠近纯化处理而设置。上游、中游各功能间均设置有退出缓冲通道，与返回走廊相连，通过门禁系统的控制，进入各退出缓冲的人、物，将不再允许返回功能间或供应走廊内。工作人员通过返回走廊，由右下角的人员退出通道消毒后退出；使用过的一次性抛弃型储物袋等废弃物通过返回走廊，由右上角的灭活功能间灭活后进入废弃物的暂存间；工衣通过返回走廊，由右上角的灭活功能间灭活后送至工衣清洗间清洗；使用非一次性器具为不锈钢转运小车，转运后的小车通过返回走廊，由右上角的消毒间进行表面消毒后，送至车暂存间待用；使用后洁具通过返回走廊，由右上角的消毒间进行消毒后进入洁具间清洗。这样以来，洁净人、物与不洁净人、物之间没有任何的交叉，也就最大限度地避免了洁净人、物与不洁净人、物之间相互影响。

3.2 上、中、下游三个阶段严格物理隔断设计

按严格的物理隔断设计，上、中、下游三个阶段各成一个区域，三套不同的空调系统，各自独立的人、物流，三个区域之间的联系也仅通过密闭管道连接，三个区域完全独立，互不干扰。图5为某公司单抗车间的布局。

车间严格物理隔断设计，上游、中游、下游三个阶段各占一个区域，各区域均配套有各自的人、物流进出通道，并配套有区域内使用的器具、清洁工具的清洁备用功能，三个区域相互独立，互不影响。上游阶段在接种间和培养间完成，培养基主要供培养功能间细胞培养使用，少量培养基供接种间工作细胞扩增使用，故培养基配置间贴临培养功能间设置，在一次性抛弃型配制袋内配制好的培养基可由转运小车直接送至培养功能间，由一次性管道在无菌焊接机的作用下与一次性抛弃型培养袋无菌对接，完成培养基的转移。工作人员通过D级走廊，经退出缓冲区域退出生产区域；使用过的一次性抛弃型储物袋等废弃物通过该区域右下角的灭活间灭活后至废物间暂存；使用的器具（转运小车）、清洁工具被认为不离开本区域而无需其他特殊处理，直接去至相应的功能间清洗即可，不会对其他任何区域造成影响。收获的培养液经除菌过滤器过滤截留后由密闭管道送至中游阶段。中游在粗纯功能间完成，此区域内缓冲液配制间配制的缓冲液仅供粗纯使用，缓冲液配制间邻近粗纯功能间而设。该区域工作人员通过相应的人流通道进出，一次性抛弃型袋等废弃物由专设的废弃物通道转运，使用的器具（转运小车）、清洁工具直接去至相应的功能间清洗，该区域完全独立，不会对其他区域造成影响。粗纯后的料液经纳滤过滤后经密闭管道送至下游阶段。下游在精纯功能间完成，此区域内缓冲液配制间配制的缓冲液仅供精纯使用，所以缓冲液配制间邻近粗纯功能间而设。该区域工作人员通过相应的人流通道进出，一次性抛弃型袋等废弃物由专设的废弃物通道转运，使用的器具（转运小车）、清洁工具直接去至相应的功能间清洗，该区域完全独立，不会对其他区域造成影响。车间布局三阶段之间完全独立，从而最大限度地避免了三个区域之间的相互影响。

图4 某公司单抗车间的布局（单向人、物流）Fig.4 The workshop plan of some monoclonal antibody drug company（the unidirectional path of the people and materials）

图5 某公司单抗车间的布局（严格物理隔断）Fig.5 The workshop plan of some monoclonal antibody drug company（Strict partition by the physical way）

4 结语

小批量（不大于2 000 L）的单抗药物生产是现阶段国内单抗药物GMP生产车间生产的主流。一次性抛弃型设备在单抗药物生产车间内能良好的避免了污染、交叉污染、混淆和差错；同时，一次性抛弃型设备可满足两条以上的生物发酵线可在同一培养区域内同时生产，使得生产周期较长上游阶段能进行错班的生产，大大提高了设备利用率和生产车间的生产效率。无论是上、中、下游三个阶段气锁隔断，单向人、物流设计理念；还是上、中、下游三个阶段严格物理隔断设计理念；均能良好地与一次性抛弃型设备完美结合。最终设计出符合GMP （2010修订版）及其他设计规范、标准的生产车间布局。

参考文献

[1]倪华，陶静，胡辉.单克隆抗体药物生产车间工程设计探讨[J].机电信息，2010，278（32）：11-21.

[2]张末初，刘江云，许李莉，等.生物制品生产企业建立GMP洁净厂房要点[J]. 医药与卫生. 356-357

[3]潘艳，张昕.单克隆抗体技术的研究进展[J].吉林工商学院学报，2014，30（5）：88-120.

[4]中华人民共和国卫生部令 第79号. 药品生产质量管理规范（2010年修订）[S].

中图分类号：TQ 460.8

文献标识码：A

文章编号：2095-817X（2016）02-009-000

收稿日期：2016-01-06

作者简介：宋弘（1989—）男，工程师，研究方向：医药工程设计。

Discussion of Engineering Design for Monoclonal Antibody Drug Workshop with Disposable Equipment

Song Hong
（Wuhan Branch, Huizhi Engineering Science & Technology Co., Ltd, Wuhan 430000）

Abstract:Currently there are two equipment for producing monoclonal antibody-traditional equipment and one time usage disposable one. Combined with the requirements in china GMP (2010 Revised Edition) and with one practical example, the layout design of workshop equipped with one time usage equipment was analyzed and discussed in this article.

Keywords:monoclonal antibody; disposable animal cells bioreactor; workshop; engineering design; GMP