猪流行性腹泻病毒LAMP检测方法的建立及初步应用

时建立、彭　喆、王莉莉、徐胜男、张玲玲、郑书轩、朱晓琳、吴晓燕、徐绍建、王金宝、李 俊（ 1.山东省农业科学院畜牧兽医研究所，山东济南　250100；2.山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室，山东济南　250100；3.青岛农业大学动物科技学院，山东青岛　266109）



猪流行性腹泻病毒LAMP检测方法的建立及初步应用

时建立1，2、彭喆1，2、王莉莉1，2、徐胜男1，2、张玲玲2，3、郑书轩2，3、朱晓琳1，2、吴晓燕1，2、徐绍建1，2、王金宝1，2、李 俊1，2
（ 1.山东省农业科学院畜牧兽医研究所，山东济南250100；2.山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室，山东济南250100；3.青岛农业大学动物科技学院，山东青岛266109）

摘要：猪流行性腹泻病毒是引起仔猪腹泻死亡的主要病原。为实现对猪流行性腹泻病毒（PEDV）的快速检测，利用PEDV S基因设计特异性引物，通过优化各种反应条件，建立了检测PEDV的环介导等温扩增快速检测方法（LAMP）。此方法特异性好，敏感度强，将反转录后的病毒cDNA稀释到108倍仍可检出，是PCR方法的100倍。本研究建立的LAMP方法操作简便、灵敏度高、特异性强，为临床PEDV的快速检测和预防奠定基础。关键词：猪流行性腹泻病毒；环介导等温扩增技术；快速诊断

猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）是引起猪水样腹泻、呕吐和高度脱水为特征的，并能够通过接触传播的肠道传染病的主要致病原，可危害各年龄猪群，其中以哺乳仔猪尤为严重，病死率80%以上。自 1978 年在比利时首先报道分离到 PEDV以来[1]，猪流性腹泻疫情（PED）在世界各地养猪业中都有暴发流行。特别是从 2010年末开始，PED暴发更频繁，造成仔猪严重腹泻和大批死亡，给养猪业带来巨大经济损失[2-4]。

快速诊断是控制PEDV的前提条件之一。针对PEDV，传统检测方法主要有病毒分离与鉴定、免疫荧光法、普通RT-PCR 技术、实时荧光定量PCR技术等[4]。此类方法操作繁琐、费时费力、所需试剂繁多、经济成本高，并且有设备和技术要求，难以在基层推广普及。

环介导等温扩增检测（LAMP）技术是2000年由Notomi等建立的一种新型核酸扩增技术。该技术可在等温条件下通过特异DNA聚合酶作用，实现对特定核苷酸序列的扩增，具有特异性高、灵敏性强、简便快速、成本低廉和结果可视化等优点，目前在一些病原微生物的检测中被广泛应用[5-7]。本试验针对PEDV S基因，建立了LAMP快速检测方法，为临床PEDV的快速诊断以及控制奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料

猪繁殖与呼吸道综合症病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪细小病毒（PPV）、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪流行性腹泻病毒（PEDV）等，由山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室保存和提供。检测用疑似病料采自济南市周边发病猪场。Bst DNA聚合酶、dNTP、DNA Marker DL-2000购自宝生物工程（大连）有限公司。其他试剂为进口或国产分析纯试剂。

1.2方法

1.2.1RNA模板的制备。取反复冻融3次后的PEDV细胞培养液250 μL，采用RNA Trizol法提取病毒RNA，用随机引物将其反转录成cDNA，-80 ℃保存备用。

1.2.2引物设计与合成。根据Genbank公布的PEDV S基因序列，利用网站http://primerexplorer. jp/e/设计LAMP特异引物，包括外引物对（F3、B3）和内引物对（FIP、BIP）。引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列见表1。

1.2.3LAMP反应条件优化。LAMP基本反应体系为25 μL，成分包括：内外引物、dNTPs、Betaine、Bst DNA 聚合酶、10 ThermoPol buffer、cDNA模板。反应温度在60~65 ℃，扩增60 min左右，80 ℃ 10 min终止反应，取扩增产物于1%琼脂糖凝胶中电泳，观察结果。也可在反应结束后，在反应管中加入1 uL SYBR GeenⅠ核酸染料，肉眼观察溶液颜色变化或在紫外下观察有无荧光。以基本反应体系为基础，为确定最佳扩增条件，选择对LAMP扩增反应影响较大的几种因素进行调整，如反应时间、反应温度、Betaine浓度、Mg2+和dNTPs浓度，对各组分进行优化。

1.2.4LAMP方法灵敏度检测。取反转录后的病毒cDNA，以生理盐水10倍倍比稀释，分别作为模板进行LAMP扩增，同时与农业部现行猪流行性腹泻诊断技术标准（NY/T 544-2015）中的RTPCR方法进行比较，确定LAMP反应的灵敏度。

1.2.5LAMP方法特异性检测。分别对PRRSV、CSFV、PPV、PCV2、PRV、TGEV和PEDV等进行LAMP扩增，检测LAMP引物的特异性。反应结束后在反应管中加入1 uL SYBR GeenⅠ核酸染料，在紫外线下观察阳性反应的特异性荧光。

1.2.6LAMP方法临床样品检测。对从济南市周边疑似发病猪场采集的病料提取RNA，并反转录成cDNA后进行LAMP检测。同时采用PCR方法检测，进行阳性率比较。

2　结果与分析

2.1LAMP条件的优化

PEDV LAMP扩增阳性结果在凝胶电泳中呈梯状条带，无模板的阴性对照扩增无条带。优化结果显示：最佳反应温度为61 ℃（图1-A），dNTPs浓度在0.35 mmol/L时扩增条带最亮（图1-B），Mg2+浓度在2.8 mmol/L时扩增条带最亮（图1-C），betaine浓度在0.8 mol/L时扩增条带最亮（图1-D）。扩增45 min即出现稳定梯状条带，而扩增60 min出现最亮条带（图1-E）。

最终优化后的LAMP反应体系为1 μL cDNA模 板，4.0 μL FIP和 BIP引 物，0.5 μLF3和B3 引 物，3.5 μL dNTPs（10 μM），2.5 μL 10 ThermoPol buffer，1 μL Bst DNA polymerase，4 μL Betaine，0.7 μL Mgso4，加入超纯水至25 μL。各反应物在61 ℃水浴60 min，然后80 ℃ 5 min灭活终止反应。

图1　优化LAMP反应条件时扩增产物1%琼脂糖凝胶电泳结果

2.2LAMP反应的灵敏度

将PEDV cDNA倍比稀释进行LAMP 反应，结果cDNA稀释到108倍仍可检出（图2-A）。将各稀释的PEDV cDNA进行PCR检测，结果显示PCR法的检出限为DNA稀释到106倍（图2-B）。

由上图可知：LAMP检测方法的最低检测量为108，常规PCR检测方法的最低检测量为106。LAMP方法的灵敏度是PCR方法的100倍。

2.3LAMP特异性检测

对7种病毒分别采用蛋白酶K法提取DNA或者Trizol法提取病毒RNA，用随机引物将其反转录成cDNA后进行LAMP反应。结果显示仅PEDV cDNA出现特征性阶梯状扩增条带；反应结束后，在反应管中加入1 uL SYBR GeenⅠ核酸染料，在紫外线下观察，也只有此管出现特异性荧光（图3）。

2.4临床样品检测结果

对从济南市周边疑似发病猪场共采集病料40份，提取RNA，并反转录成cDNA后进行LAMP检测。同时采用PCR方法进行检测，两者进行阳性率比较。

检测结果发现采用PCR方法共检测到10份阳性病料，阳性率为25%，采用LAMP方法共检测到20份阳性病料，阳性率为50%，同时采用PCR方法检测为阳性的样品在LAMP检测时都为阳性。（部分样品检测结果见图4）。

3　讨论

PEDV是由I型冠状病毒引起的，以猪腹泻、呕吐和脱水等为主要特征的病毒性肠道传染病，对仔猪危害尤其严重，严重影响养猪业的健康发展。由于CV777弱毒苗或灭活苗的广泛使用，2010年以前，PED在猪场基本处于可防控状态。之后由于毒株变异或者环境的改变，PED在世界范围内广泛暴发流行，甚至包括免疫过的猪场，给养猪业造成巨大损失[2，8-9]。

传统方法检测PEDV不仅操作繁琐，而且耗时较长，且有设备和技术要求，难以在基层推广普及。本实验建立的LAMP检测方法只需在61 ℃条件下进行等温扩增60 min后，再在80 ℃条件下加热5 min让酶失活即可，并且LAMP 的扩增产物可以通过凝胶电泳或者加入荧光染料的方法观察结果。与汤小真等[10]建立的方法不同，此方法没有在实验过程中添加染料，避免了对检测灵敏性和特异性的影响。该技术在等温条件下即可进行核酸变性和扩增，不需要特殊的仪器设备，仅在水浴锅中就可完成扩增反应，适合在基层兽医站和养殖场等一线单位推广应用。该方法方便快捷、成本低廉、特异性强，灵敏度是PCR检测方法的100倍，对PED的有效防控具有重要意义，在PEDV的快速检测方面具有较好的应用前景。

图2　LAMP反应灵敏度检测结果

图3　LAMP特异性检测结果

图4　部分临床样品LAMP检测（A）和PCR检测（B）结果

参考文献：

[1] Pensaert M B，De Bouck P. A new coronavirus -like particleassociated with diarrhea in swine[J]. Arch Virol，1978，58（3）：243-247.

[2] Kang T，Seo J，Kim D，et al. Cloning and sequence analysis of the Korean strain of spike gene of porcine epidemic diarrhea virus and expression of its neutralizing epitope in plants[J]. Protein Expression and Purification，2005，41 （2）：378-383.

[3]施标，董世娟，朱于敏，等. 中国猪流行性腹泻病毒分子流行病学研究进展[J]. 中国农业科学，2013，46（20）：4362-4369.

[4] 郑逢梅，霍金耀，赵军，等.2010-2012年华中地区猪流行性腹泻病毒分子特征和遗传进化分析[J]. 病毒学报，2013（2）：197-205.

[5] Notomi T， Okayama H， Masubuchi H，et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J]. Nucleic Acids Res，2000，28：E63.

[6] Zhou S，Han S，Shi J，et al. Loop-mediated isothermal amplification for detection of porcine circovirus type 2[J]. Virol J，2011，8：497-502. DOI：10.1186/1743-422X-8-497.

[7] Techathuvanan C，Draughon F A，D'Souza D H. Comparison of reverse transcriptase PCR，reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification，and culture-based assays for Salmonella detection from pork processing environments[J]. J Food Prot，2011，74：294-301.

[8]张世，忠江斌. 2011 年福建省猪流行性腹泻的流行特点及其防治措施[J]. 福建畜牧兽医，2012，34（2）：23-25.

[9] Park S J，Kim H K，Song D S，et al. Molecular characterization and phylogenetic analysis of porcine epidemic diarrhea virus （PEDV）field isolates in Korea[J]. Arch Virol，2011，156：577-585.

[10] 汤小真，陈露薇，卢荣彬，等. 基于钙黄绿素显色的可视化LAMP检测猪流行性腹泻病毒的研究[J]. 中国畜牧兽医，2015，42（2）：331-336.

（责任编辑：朱迪国）

Establishment and Preliminary Application of LAMP for Porcine Epidemic Diarrhea Virus Detection

Shi Jianli1，2，Peng Zhe1，2，Wang Lili1，2，Xu Shengnan1，2，Zhang Lingling2，3，Zheng Shuxuan2，3，Zhu Xiaolin1，2，Wu Xiaoyan1，2，Xu Shaojian1，2，Wang Jinbao1，2，Li Jun1，2
（1.Institute of Animal Science and Veterinary Medicine，Shandong Academy of Agricultural Sciences，Jinan，Shandong 250100 ；2.Shandong Key Laboratory of Animal Disease Control and Breeding，Jinan，Shandong 250100 ；3.College of Animal Science and Technology，Qingdao Agricultural University，Qingdao，Shandong 266109）

Abstract：Porcine epidemic diarrhea virus（PEDV）is a major etiological factor of diarrhea and death in piglets. Loopmediated isothermal amplification（LAMP）assay for rapid detection of PEDV was developed and it could complete detection within 60 min. Both agarose gel electrophoresis and naked eyes were able to detect the products in the LAMP assay. The sensitivity of LAMP could reach to 108dilutions. These results indicated that the new LAMP method was a very simple and efficient detection method with high sensitivity and specificity for the clinical diagnosis of PEDV in swine farms，which would suit the requirements of rapid detection in laboratory and general conditions.

Key words：PEDV；LAMP；rapid detection

中图分类号：S851.3

文献标识码：B

文章编号：1005-944X（2016）07-0082-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2016.07.025

基金项目：山东省现代农业产业技术体系疫病控制岗位（SDAIT-06-021-07）；山东省农业重大应用技术创新课题

通讯作者：李俊