低能N+注入选育凝结芽孢杆菌高效生防菌株

顾鹏飞，吴 刚，胡永红，王春晓，丁志雯，杨文革

(南京工业大学 生物与制药工程学院，江苏 南京 211816)

低能N+注入选育凝结芽孢杆菌高效生防菌株

顾鹏飞，吴 刚，胡永红，王春晓，丁志雯，杨文革

(南京工业大学 生物与制药工程学院，江苏 南京 211816)

为了进一步提高凝结芽孢杆菌NJYHHWG 877005菌株的拮抗性能，获得生防效果更好的菌株，利用低能N+注入菌株进行诱变，并通过平板对峙培养对诱变处理后的菌株进行筛选。结果表明，菌株存活率曲线遵循N+注入生物效应的马鞍型曲线，根据其存活率及突变率确定N+最佳注入能量为15 keV,最佳注入剂量为140×1013个/cm2。通过筛选获得1株具有良好性状的突变株L1，芽孢形成率达77.42%，对灰葡萄孢霉菌的抑制率高达87.81%，分别较原始出发菌株提高了23.79、11.71个百分点，且连续传代培养8次，遗传稳定性良好。

凝结芽孢杆菌； N+注入； 诱变选育； 遗传稳定性； 抑菌率

凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)是近年来益生菌领域的后起之秀，除具有乳酸菌和双歧杆菌等的保健功效外，还具有耐高温、耐酸和耐胆盐等高抗逆性，且具有较强的抑制肠道致病菌能力[1]。被用于微生态制剂的枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌虽名为减毒或无毒菌株，但安全性仍不如凝结芽孢杆菌。1992年美国FDA公布了5种芽孢杆菌可以用于饲料的安全菌株，凝结芽孢杆菌名列第1位[2]。凝结芽孢杆菌在国外已被广泛应用于保健、医疗、食品和畜牧等领域，是较具应用潜力的芽孢杆菌菌种之一，但是在农业领域的应用甚少。研究表明，凝结芽孢杆菌通过分泌抗生物质和生长竞争等方式在植物病害生物防治方面起着重要作用[3-4]；另外，凝结芽孢杆菌在生长过程中也可产生一些促进植物生长的物质，例如玉米素、异戊烯基腺嘌呤和玉米素核苷等。然而由于符合工业化生产需求的优良稳定菌株缺乏，严重制约着其在农业领域的应用[5-6]。

离子注入诱变选育技术是20世纪80年代兴起的一种综合诱变技术，是集物理、化学诱变因子于一身的复合诱变方法，与传统的物理、化学诱变因子相比，离子注入诱变除有能量、质量沉积外，还有动量传递及电荷交换等效应，可导致微生物的遗传物质发生改变，具有损伤轻、突变率高、突变谱广、遗传稳定、易于获得理想新种质等特点，现已广泛应用于微生物改良方面[7]。国内外相继有离子注入微生物后，获得目标性能提高、遗传稳定菌株的研究报道[8-10]。

本研究利用N+注入诱变技术对凝结芽孢杆菌 NJYHHWG 877005菌株进行改良，考察了不同能量和剂量的N+注入对凝结芽孢杆菌 NJYHHWG 877005的诱变效应，以期筛选出生物防治效果良好的菌株。

1 材料和方法

1.1 试验菌种

实验室自主筛选益生菌株：凝结芽孢杆菌NJYHHWG 877005。

病原真菌：灰葡萄孢霉菌，由江苏省农业科学院植物保护研究所生物防治实验室分离保存。

1.2 培养基

固体平板培养基：蛋白胨10.00 g/L、酵母膏5.00 g/L、NaCl 5.00 g/L、琼脂粉20.00 g/L，pH值7.0～7.2。

种子培养基：蛋白胨10.00 g/L、酵母膏5.00 g/L、NaCl 1.00 g/L、葡萄糖 60.00 g/L，pH值7.0～7.4。

发酵培养基：蛋白胨12.00 g/L、酵母膏15.00 g/L、葡萄糖22.00 g/L、MnSO4·H2O 0.000 2 g/L、CaCO30.02 g/L。

马铃薯蔗糖琼脂(PSA)培养基：土豆200.00 g/L、蔗糖20.00 g/L、蛋白胨5.00 g/L、琼脂粉20.00 g/L，pH值7.0～7.5。

1.3 试验方法

1.3.1 培养及诱变方法

1.3.1.1 菌种培养 平板培养：将凝结芽孢杆菌 NJYHHWG 877005菌种接到固体平板培养基中，温度为37 ℃，培养时间为2～3 d。

种子培养：从培养好的平板中选取1个单菌落，转接到100 mL种子培养基中，在37 ℃、180 r/min条件下培养18 h。

发酵培养：将种子培养液以5%接种量接种到100 mL发酵培养基中，在180 r/min、37 ℃条件下培养24 h。

1.3.1.2 N+注入诱变 取0.1 mL培养至指数生长期的发酵液，均匀涂布于无菌空白培养皿中，以在显微镜下观察无相互重叠的细胞为最佳，用无菌风吹干，采用LZD900多功能N+注入机进行N+注入。N+能量为10～20 keV，剂量为20×1013～200×1013个/cm2，靶室真空度为10-3Pa，以5 s脉冲式注入，间隔15 s。

1.3.1.3 诱变后培养 将经过N+注入的培养皿取出，用1 mL无菌的生理盐水进行洗脱，稀释107倍后取0.1 mL涂布于固体平板培养基上，置37 ℃下培养，计算单菌落数目，统计其存活率以备筛选。

1.3.2 筛选方法

1.3.2.1 初筛 取一个洁净的载玻片，于中央滴1滴无菌水，挑取处理后样品生长的1个单菌落置载玻片上涂匀，在酒精灯火焰上烘干，用结晶紫染色1～2 min，在电子显微镜下观察菌体及芽孢的形态。

1.3.2.2 复筛 挑取符合凝结芽孢杆菌菌落形态特征、长势较好的单菌落进行摇瓶发酵培养，测定活菌体数量、芽孢数量以及对灰葡萄孢霉菌的抑制率，最终挑选出一株性状良好的菌株。相关测定方法如下：

①芽孢数量的测定 分别取1 mL经80 ℃热处理10 min和未经热处理的发酵液，稀释107倍后转移到固体平板培养基中，37 ℃恒温培养36～40 h，统计菌落数，分别为其芽孢数和活菌数，每个处理设置3个平行。

②抑菌率的测定 采用平板对峙法，待活化好的病原菌菌落长至1元硬币大小时，用打孔器在边缘打取直径为8 mm的菌丝块，挑入PSA平板中线外1/3处，培养24 h后，在同一中线的另1/3处接入10 μL发酵液(摇瓶培养30 h)，37 ℃恒温培养72 h，记录病原菌菌落直径，每个处理重复3次，以只接病原菌的平板作为对照。

1.3.3 突变率的计算 以出发菌株为对照，考察诱变后凝结芽孢杆菌对灰葡萄孢霉菌的抑制率。诱变后抑菌率较原始出发菌株低5%以上的为负突变株，高5%以上的为正突变株，介于两者之间的视为无突变。负突变率是指负突变株占全部考察菌株的百分率，正突变率是指正突变株占全部考察菌株的百分率，总突变率为正突变率与负突变率之和。

2 结果与分析

2.1 N+注入对菌株存活率的影响

由存活率曲线(图1)可以看出，随着N+注入剂量的逐渐增加，菌株的存活率呈现先下降后短暂上升再下降，最后趋于零的趋势，呈明显的“马鞍型”变化。在N+注入剂量达到140×1013个/cm2时，菌株的存活率最高，达44.9%，活菌数目达到4.12×109cfu/mL；而后存活率逐渐下降，当注入剂量达到200×1013个/cm2时，菌株的存活率趋于零。

图1 不同剂量N+注入对菌株存活率的影响

2.2 N+注入对菌株突变率的影响

2.2.1 不同能量N+注入对菌株突变率的影响 从图2可知，不同注入能量对菌株的正突变率产生影响。当N+注入能量小于15 keV 时，菌株的正突变率随能量的增加而增加，而当注入能量大于15 keV 时，正突变率反而下降，原因可能是能量太高使得细胞内一些遗传物质损伤过于严重。注入能量为15 keV时诱变后菌株的正突变率为19.4%，明显高于注入能量为10 keV和20 keV的正突变率，因此最佳注入能量为15 keV。

图2 不同能量N+注入对菌株突变率的影响

2.2.2 不同剂量N+注入对菌株突变率的影响 由图3可知，当N+注入剂量逐渐增加时，凝结芽孢杆菌NJYHHWG 877005菌株的正突变率呈现先上升后下降的趋势，与存活率的走势大致相同，当注入剂量达140×1013个/cm2时，正突变率达最大值(18.3%)。该菌株正突变率的最高点所对应的注入剂量和由存活率推出的最佳注入剂量相吻合，据此可以确定最佳注入剂量为140×1013个/cm2。

图3 不同剂量N+注入对菌株突变率的影响

2.3 性状优良菌株的筛选结果

将凝结芽孢杆菌NJYHHWG 877005发酵液在N+最佳注入能量15 keV、最佳注入剂量140×1013个/cm2下进行处理，而后进行平板培养，从表面湿润、平坦，边缘整齐而有光泽，长势良好且符合凝结芽孢杆菌菌落形态特征的菌落中，挑取最好的10个菌落分别进行摇瓶发酵培养，用培养36 h的发酵液测定芽孢形成率及对灰葡萄孢霉菌的抑制率。

表1 原始菌株与各突变株的芽孢形成率及抑菌率 %

由表1可知，诱变后的菌株较原始菌株在芽孢形成率和抑菌率上均有所改变，其中突变株2的芽孢形成率最高，达83.66%；突变株5的抑菌率最高，达89.14%，但其芽孢形成率仅为45.71%。因芽孢形成率对于凝结芽孢杆菌的生物防治效果以及所开发的相关产品质量起着至关重要的作用，综合考虑选择突变株7为最佳诱变菌株，其芽孢形成率为77.42%，抑菌率达87.81%，较原始菌株分别提高了23.79、11.71个百分点，将该菌株命名为L1。

2.4 筛选菌株的遗传稳定性

对筛选出的突变株L1进行连续8代的传代试验，由图4可知，原始菌株与突变菌株随传代次数的增加，对灰葡萄孢霉菌的抑制率虽稍有下降，但趋于平稳，突变株L1的最高抑菌率达87.81%，传至第8代其抑菌率依然可达到77.90%，证明该突变株具有良好的遗传稳定性。

图4 突变菌株L1的遗传稳定性

3 结论与讨论

N+注入诱变的菌株存活曲线为马鞍型曲线，与传统的物理、化学诱变方法产生的菌株存活曲线呈指数型或肩型不同，相关研究表明，低能N+注入时离子能量沉积与动量传递等效应对细胞表面具有损伤，随N+注入剂量的增大能量沉积产生大量的自由基，导致生物膜与 DNA 等生物大分子损伤，菌株存活率下降，当注入剂量继续增加，持续注入的大量电荷堆积产生强库仑斥力，对菌体产生一个“保护性屏障”，并且大量堆积的电荷形成一个弱电场，弱电场的刺激效应可以激活菌体细胞内的修复机制，增强细胞修复损伤的效率，于是存活率又有所回升，当注入剂量继续上升超出了细胞自身的修复能力时，存活率再次下降[11-13]。

本研究利用低能N+注入技术对凝结芽孢杆菌 NJYHHWG 877005菌株进行改良，考察了不同能量和不同剂量N+注入NJYHHWG 877005的诱变效应，发现不同突变株的菌落形态、芽孢形成率以及生防效果存在差异，这说明低能离子对凝结芽孢杆菌产生了生理生化类型的表型效应[14]。通过在N+最佳注入能量15 keV、最佳注入剂量140×1013个/cm2下进行诱变处理，筛选出1株性状优良的高效生防菌株L1，其芽孢形成率和抑菌率分别较原始出发菌株提高了23.79、11.71个百分点。要得到更高效的优良菌株，需要进一步的离子注入试验，同时对突变株的发酵条件进行深入研究。

本试验在筛选突变菌株时，采用的是突变菌株和灰葡萄孢霉菌对峙培养的方法，今后将对突变菌株产生的次生代谢物质的种类及数量进行快速定量分析，提高筛选效率，为更好地利用离子注入技术提高生防菌的拮抗能力提供参考。

[1] 董惠钧,姜俊云,郑立军,等.新型微生态益生菌凝结芽孢杆菌研究进展[J].食品科学,2010,31(1):292-294.

[2] 戴青，赵述淼，谢树贵，等.一株凝结芽孢杆菌的分离筛选及生物学特性研究[J].饲料工业,2008,29(12):36-38.

[3] 林毅,陈金辉,黄志鹏.芽孢杆菌几丁质酶及其在植物病虫害生物防治中的应用[J].福建农业科技,1998(S1):32-34.

[4] 肖瑞峰,闫艳华,宗志友,等.凝结芽孢杆菌TQ33产抗疫霉物质特性研究[J].天津科技大学学报,2011,26(6):1-6.

[5] Clark C A,Lorbear J W.The role of phyllosphere bacteria in pathogenesis byBotrytiscinereaand its relevance to grey mould development[J].Annis of Applied Biology,1977,109:545-559.

[6] Jorjani M,Heydari A,Zamanizadeh H R,etal.Controlling sugar beet mortality disease by application of new bioformulations[J].Journal of Plant Protection Research,2012, 52(3):303-307.

[7] Yu Z L.Introduction to ion beam biotechnology[M].New York:ISBN,2006:55-86.

[8] 叶枝青,姚建铭,余增亮.离子注入选育高效植物病原真菌拮抗菌JA[J].激光生物学报,2001,10(4):293-297.

[9] 黄群策,张锡亭,向茂成.离子束生物工程的现状与展望[J].湘潭师范学院学报(自然科学版),2001,23(3):78-82.

[10] 李德全,陈志谊,刘永锋，等.生防菌Bs-916离子注入突变高效菌株筛选及抑菌防病效果[J].植物保护学报,2006,33(2):141-145.

[11] 张宁,蒋剑春.氮离子注入纤维素酶产生菌的诱变效应研究[J].应用基础与工程科学学报,2011,19(6):900-906.

[12] 解继红,包金刚,徐柱,等.离子束对生物体的作用原理及应用[J].基因组学与应用生物学,2010,29(4):761-767.

[13] 宋道军,姚建铭,吴丽芳,等.离子注入对微生物细胞的刻蚀与对DNA 的损伤及修复[J].遗传,1999,21(4):37-40.

[14] 邓小军，周国英，刘君昂,等.N+注入选育高毒力球孢白僵菌菌株及对3种油茶害虫的毒力测定[J].中国生物防治学报,2012,28(3)：341-347.

Mutation Breeding of High-efficiency Biocontrol Strain ofBacilluscoagulansby Low Energy N+Ion Beam Implantation

GU Pengfei,WU Gang,HU Yonghong,WANG Chunxiao,DING Zhiwen,YANG Wenge

(College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Nanjing Tech University,Nanjing 211816,China)

In order to improve the antagonistic ability ofBacilluscoagulansNJYHHWG 877005 and search for high-efficient mutant strains,the strain was induced by low energy N+ion beam implantation and the mutation strains were screened by confrontation experiments.It was found that the curve of survival took a “saddle shape” with N+ion dose increased.By the livability and mutation rate of the strain, the best induced mutation action was decided when the used energy and ions implantation dose were 15 keV and 140×1013N+/cm2.A fine strain L1 was obtained through screening.The forming rate of spore was up to 77.42%,and the inhibition rate of the mutant strain againstBotrytiscinereawas up to 87.81%,increased by 23.79 and 11.71 percentage points compared to the primitive strain,respectively.After eight generations of propagation,the mutant strain showed high genetic stability.

Bacilluscoagulans; N+ion beam implantation; mutation breeding; genetic stability; inhibition rate

2015-10-27

江苏省农业科技自主创新资金项目(CX(14)2057)；江苏省科技支撑计划(农业)项目(BE2014386)

顾鹏飞(1990-)，男，河南南阳人，在读硕士研究生，研究方向：生物农药。E-mail：18351870291@163.com

*通讯作者：胡永红(1968-)，女，江苏如皋人，教授，博士，主要从事植物病虫害防治研究。E-mail：yonghonghu11@126.com

S476.1;Q319+.2

A

1004-3268(2016)05-0087-04