青鹏软膏治疗大鼠实验性湿疹皮炎的作用机理

陈伟

(天津市第五中心医院 皮肤科，天津 300450)

青鹏软膏治疗大鼠实验性湿疹皮炎的作用机理

陈伟Δ

(天津市第五中心医院 皮肤科，天津 300450)

目的 分析青鹏软膏对湿疹皮炎大鼠治疗的作用机理。方法 将湿疹皮炎造模成功的14只大鼠随机分成对照组和研究组，对照组不给予任何处理，研究组给予青鹏软膏治疗，另选取7只大鼠为正常组，采取免疫组织化学法检测皮肤组织中高迁移率族蛋白1(high mobility group protein，HMGB)、Toll样受体4(Toll like receptor 4，TLR4)及白细胞介素(interleukin-17，IL-17)蛋白表达水平。结果 对照组BUN显著高于正常组，研究组BUN显著低于对照组，而高于正常组(P<0.05)。研究组和对照组大鼠IL-17、HMGB1、TLR4在皮肤组织中的表达水平均较正常组明显升高，而研究组大鼠3项指标水平较对照组大鼠明显下降，上述对比差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 青鹏软膏抑制湿疹皮炎大鼠HMGB1、TLR4、IL-17表达，并改善症状。

湿疹皮炎；青鹏软膏；IL-17；HMGB1；TLR4

湿疹皮炎是一种常见的由多种内外因素引起的表皮及真皮浅层的炎症性皮肤病。其特点为自觉剧烈瘙痒，皮损多形性，对称分布，有渗出倾向，慢性病程，易反复发作[1-2]。目前，关于湿疹皮炎的临床研究较多，但其发病机制并未完全研究透彻，但有研究分析发现细胞因子高迁移率族蛋白1(high mobility group protein，HMGB)在湿疹皮炎致病中起着至关重要的作用，而Toll样受体4(Toll like receptor 4，TLR4)受体细胞及白细胞介素(interleukin-17，IL-17)表达与其有着紧密的协同作用[3-4]。本研究分析青鹏软膏对湿疹皮炎大鼠皮肤组织中IL-17、HMGB1、TLR4表达的影响及作用，选取3组大鼠进行了对比研究，意在探究青鹏软膏治疗湿疹皮炎的作用机制，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及分组：选取14只雄性Wistar大鼠为湿疹皮炎模型，体质量18～24 g，随机分为对照组和研究组，另同时选取7只大鼠为正常组，所有选取大鼠均引种自美国Jackson实验室，由北京大学医学部免疫学系繁殖饲养，均于试验前饲养1 w适应后进入实验，自由饮食、饮水，开始实验及终止实验时间：12周龄初～16周龄末。

1.1.2 主要试剂：免疫组化检测试剂盒(上海研卉生物科技有限公司)、兔抗大鼠TLR4多克隆抗体、兔抗大鼠HMGB1多克隆抗体、兔抗大鼠IL-17多克隆抗体(所有抗体均购自美国Abcam公司)、青鹏软膏(西藏奇正藏药股份有限公司，国药准字421400Z50,20g/支)。

1.1.3 主要仪器：TU-1801紫外可见光分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)；KHB，ST-360型酶标仪(上海科学实验仪器有限公司)；TL-18M台式高速冷冻离心机(上海市离心机械有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 实验方法：除正常组外其他2组大鼠均于第1天于后背剪毛约2 cm×3 cm,并涂5%二硝基氯苯(DNCB)30 μL于皮肤首次致敏，7d后在大鼠右耳内侧涂0.2%的DNCB 50 μL激发，以后每隔3 d激发1次，连续5次。于第4、5次激发后24、36、72 h观察大鼠右耳较左耳壳明显红肿，并出现渗出和结痂，表明造模成功。模型建立后，对照组和正常组大鼠均给予常规饲养，不给予其他处理，而研究组大鼠于试验起点时于大鼠湿疹患处涂抹青鹏软膏，每天2次，一共28 d。

1.2.2 标本采集方法：3组大鼠均于28 d时，行眼眶取血2 mL，常规分离(2000 r/min,离心10 min)血清后处死；将处死后大鼠双侧皮肤皮质组织取样，并分别行4%多聚甲醛、2%戊二醇固定；同时，切取部分组织冷冻，于-72 ℃环境下冷藏备用。

1.2.3 检测方法：①尿素氮(BUN)检测：对3组大鼠BUN水平用AU-400全血自动生化分析仪进行检测；②免疫组化检测：免疫组织化学法对取样皮肤组织中的IL-17、HMGB1及TLR4蛋白的表达水平进行检测：行常规切片→脱蜡水化→HE染色→抗原修复→稀释后IL-17多克隆抗体、HMGB1多克隆抗体及TLR4多克隆抗体处理(一抗与二抗的稀释比例均为1:200)→4 ℃过夜；阴性对照用PBS代替一抗。免疫组化结果利用Leica 全自动显微镜(model DMLA，Leica Inc.，德国)统一在400×(10×40)采集图像，并利用Image-Pro Plus 图像分析软件(Version 4.1, Media Cybernetics)进行灰度分析，以反映响应蛋白的表达水平。

2 结果

2.1 BUN水平对比 对照组为(9.62±0.81)μmol/L，与正常组(6.92±0.94)μmol/L比较差异具有统计学意义(t=5.76，P<0.05)。研究组(8.34±0.80)μmol/L与对照组和正常组相比差异均具有统计学意义(t=2.97，t=3.04，P<0.05)。

2.2 免疫组化检测结果 免疫组化结果见图1、表1。与正常组比较，对照组皮肤组织中IL-17、HMGB1、TLR4蛋白表达水平显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。研究组皮肤组织中上述指标较正常组高，但显著低于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。

图1 IL-17、HMGB1和TLR4在研究组和对照组皮肤组织中的免疫组化结果(×400)Fig.1 The immunohistochemical results of IL-17, HMGB1 and TLR4 in skins of two groups of rats(×400)

组别 IL-17(ng/mL)HMGB1(μg/L)TLR4(ng/L)正常组1.07±0.051.00±0.041.01±0.08对照组1.51±0.11*1.33±0.07*1.37±0.11*研究组1.29±0.09*#1.17±0.05*#1.19±0.09*#

*P<0.05，与正常组比较，compared with normal group；#P<0.05，与对照组比较，compared with control group

3 讨论

湿疹皮炎病理改变具有多样性及非均一性，湿疹为多数粟粒大红色丘疹、丘疱疹或水疱，伴有明显点状或小片状糜烂，渗液，结痂。损害境界不清。合并感染时可出现脓疱、脓性渗出及痂屑等[5-6]。湿疹皮炎的发病机制复杂，其发病机制与遗传、免疫、环境、生理等多种因素有关，且此类疾病发病初期比较隐匿或急骤，发作凶险且治疗后易出现复发现象，这些均给临床治疗带来了困难[7-8]。湿疹皮炎发病机理目前尚无肯定的、可重复验证的、动物实验与临床结果一致的结论[9-10]。目前多数学者认为，一些外来抗原(如逆病毒)和内源性抗原作用于免疫调节功能异常的患者，使B淋巴细胞高度活跃增殖，产生大量自体抗体，并与相应抗原结合形成免疫复合物沉积于皮肤小球是湿疹皮炎的主要发病机制[11-12]。DNA与皮肤小球基底膜结合，并与循环中抗DNA抗体原位形成免疫复合物亦可参与湿疹皮炎的发生。一些补体成分的缺陷以红细胞和吞噬细胞上FC或C3b受体密度减低，对免疫复合物的清除能力下降，可增加免疫复合物在组织中的沉积，加重组织损害[13-14]。补体激活，趋化因子形成，白细胞聚集，再释出一系列炎症介质及细胞因子，导致小血管炎症及皮肤小球损害。与此同时，皮肤组织也有明显白细胞和巨噬细胞浸润，这与细胞间粘附因子(ICAM)及MHC抗原有关[15-16]。由于湿疹皮炎的发病机制十分复杂，因此其皮肤病理改变也呈多样化及多变化，每一患者的皮肤组织及小血管均可能出现不同的改变。湿疹皮炎主要组织学改变在皮肤组织，但是皮肤小血管的改变同样也决定患者的预后。皮肤组织病理的损伤，在很大程度上取决于抗体沉积的数量和所诱发的炎症反应的强度。持续的抗体沉积，不断引发炎症，最终导致不可逆的损害。其皮肤病理改变的特征为：“铁丝圈”病损：由于内皮沉积物而使基膜增厚，电镜和免疫荧光检查有大量的内皮下沉积物，是湿疹皮炎皮肤损害的重要特征；苏木素小体：一般认为是抗核体在原位造成细胞损伤所致，由核染色聚集而成；坏死性血管炎：微动脉和毛细血管呈纤维素坏死；电镜下可见电子致密物沉积、核碎裂、病毒样颗粒和包涵物；免疫荧光检查：有弥漫性颗粒状沉积物，以IgG、C3为主[17-18]。

传统治疗湿疹皮炎的临床方案为糖皮质激素和环磷酰胺，虽然在一定程度上使得患者得到治愈，但其有效率不稳定，且长期使用糖皮质激素和环磷酰胺会出现感染、高血糖、高血压、消化道溃疡以及肝毒性、性腺损坏等不良反应[5-6]。目前如何提高临床治疗效果以及抑制复发和不良反应的出现、减少用药量等已经成为近年来湿疹皮炎临床治疗的研究热点[19]。本研究结果显示，湿疹皮炎会直接导致大鼠体内血液中BUN的含量上升(P<0.05)，这说明该病症会直接对大鼠皮肤功能造成损害，而给予青鹏软膏处理后，发现研究组大鼠BUN水平较对照组下降(P<0.05)，这说明青鹏软膏在一定程度上有助于改善大鼠皮肤功能的作用；湿疹皮炎大鼠模型皮肤组织中IL-17、HMGB1、TLR4蛋白表达水平均较正常组明显提升(P<0.05)，这说明3者在皮肤致炎中可能起到一定的致炎作用，且3者之间呈现为协同作用，而这一研究结果得到了陈宁等的证实[9-10]；另外，研究组大鼠在给予青鹏软膏处理后，发现该组大鼠皮肤组织中三指标蛋白表达水平较对照组大鼠明显下降(P<0.05)，这说青鹏软膏在一定程度上具备治疗湿疹皮炎的效果，其能抑制上述三项指标的蛋白表达，进而起到缓解炎症的作用。

综上所述，青鹏软膏能抑制IL-17、HMGB1、TLR4在皮肤组织中的表达，一定程度上能够防止湿疹皮炎，这对于治疗因湿疹皮炎引发的系统性红斑狼疮有一定的临床价值。

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(编校：王俨俨)

Mechanism of Qingpeng ointment in the treatment of experimental eczema dermatitis in rat

CHEN WeiΔ

(Department of Dermatology, Tianjin Fifth Central Hospital, Tianjin 300450, China)

ObjectiveTo study the effect of Qingpeng ointment on LI-17, HMGB1 and TLR4 expression levels in the rat with eczema dermatitis.MethodsFourteen rats established eczema dermatitis model were randomly divided into study group and control group, control group were not given any treatment, study group

Qingpeng ointment, another 7 rats were selected as normal group.The expression levels of high mobility group protein (HMGB), Toll like receptor 4 (TLR4) and interleukin-17 (IL-17) in skin were detected by immunohistochemistry.ResultsThe BUN in control group was higher than the normal group, the BUN in study group was lower than the control group but higher than normal group(P<0.05).The expression levels of IL-17,HMGB1 and TLR4 in skin of study group and control group were higher than normal group,respectively,while the above indicators in study group were lower than control group (P<0.05).ConclusionQingpeng ointment could inhibit the expression levels of HMGB1, TLR4 and IL-17 in the rat with eczema and dermatitis, and improve the symptoms.

eczema dermatitis; Qingpeng ointment; IL-17; HMGB1; TLR4

陈伟，通信作者，女，副主任医师，研究方向：变态反应性疾病，E-mail: chenweixs111@163.com。

R758.23

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.05.14