复方黄柏液对家兔皮肤创口肉芽组织增生的影响

张硕峰，贾占红，吴金英，丁岩，魏芸，孙建宁

(北京中医药大学，北京 100102)

复方黄柏液对家兔皮肤创口肉芽组织增生的影响

张硕峰，贾占红，吴金英，丁岩，魏芸，孙建宁Δ

(北京中医药大学，北京 100102)

目的 观察复方黄柏液对家兔皮肤破损创口愈合以及对肉芽组织中TGF-β1、VEGF、FGF-7表达的影响。方法 15只家兔随机分为5组，即对照组、京万红组、复方黄柏液0.3、0.2、0.1 mL组，用手术刀在每只家兔耳内侧做长方形切口复制皮肤切除性伤口模型，分别使用复方黄柏液0.3、0.2、0.1 mL及京万红软膏外敷伤口，给药5 d，以肉芽组织覆盖率评价创面愈合情况，并通过免疫组化方法观察创口肉芽组织中TGF-β1、VEGF、FGF-7的表达。结果 复方黄柏液可不同程度提高创口肉芽组织覆盖率，使创口肉芽组织中VEGF、FGF-7的表达增加，显著高于对照组(P<0.05，P<0.01)。结论 复方黄柏液可明显促进肉芽组织增生，促进皮肤伤口的愈合。

复方黄柏液；创口愈合；TGF-β1；VEGF；FGF-7

复方黄柏液由黄柏、连翘、金银花、蒲公英、蜈蚣组成。前期研究结果表明复方黄柏液具有抗感染，促进皮肤伤口愈合的作用[1]。结合前期实验经验，本研究仍采用兔耳创伤模型，但改变了创口的形状，采用长方形切口，垂直于创口长轴取材，便于对创口愈合进行多指标监测，而不受圆形伤口的限制[2]。以创口肉芽组织覆盖率，肉芽组织中TGF-β1、VEGF、FGF-7的表达作为观测指标，以确定复方黄柏液对创口愈合的影响，并初步分析其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：大耳白家兔，15只，雄性，2～2.5 kg。北京市昌扬西山养殖场提供，许可证编号：SCXK(京)2011-0010，合格证号：11402300001140。

1.1.2 药品和试剂：复方黄柏液(批号：1209101，规格：100 mL/瓶，山东汉方制药有限公司)，京万红软膏，(批号：211954，规格：20 g/支，天津达仁堂京万红药业有限公司)。第一抗体: VEGF抗体(博士德BA0407)；TGF-β1抗体(博士德BA0290)；FGF7抗体(博士德BA0853)。免疫组化染色试剂盒：Histostain-Plus Mouse Primary (Cat. No. 85-6643, Invitrogen, USA)；Histostain-Plus Rabbit Primary(Cat. No. 85-6743, Invitrogen, USA)。DAB Kit (Cat. No. 00-2014, Invitrogen, USA)。

1.2 方法

1.2.1 造模方法：实验前在家兔耳廓内侧用75%酒精擦拭。第2天用2把手术刀并联(间隔5 mm)在家兔左右耳内侧，各做5 mm×10 mm长方形切口，撕去损伤皮肤，用消毒棉签擦拭至软骨板完全暴露，软骨板未见明显损伤即为造模成功，用胶贴棉覆盖伤口并医用胶布固定，复制皮肤切除性伤口模型。

1.2.2 分组给药：将造模家兔随机分为5组，每组3只，即对照组、京万红组、复方黄柏液0.3、0.2、0.1 mL组。造模后即刻将相应药物原液(京万红软膏约0.2 g/处创口)滴加或涂抹在医用胶贴棉贴处，覆盖伤口并医用胶布固定。每天换药1次，对照组使用生理盐水0.3 mL/处创口。共给药5 d。

1.2.3 指标检测：取家兔耳部创面连同边缘区域，4%甲醛溶液固定，垂直包埋，垂直创口长轴切片，做HE染色，免疫组化检测VEGF、TGF-β1、FGF7在创口肉芽组织中的表达。镜下观察测量伤口肉芽组织未覆盖区域距离，并计算肉芽组织覆盖率。

免疫组化各指标各样本随机选取创口肉芽组织3个视野，用图像分析软件Image pro-plus6.0，分别计算各视野IOD值，并计算均值。

2 结果

2.1 复方黄柏液对家兔耳部皮肤切除性伤口愈合的影响 与对照组相比，各剂量复方黄柏液可不同程度促进家兔切除性伤口的愈合，使创口肉芽组织覆盖率增加(P<0.05，P<0.01)。见表1。

表1 复方黄柏液对家兔耳部皮肤切除性伤口愈合的影响

*P<0.05，与对照组相比较，compared with control group

2.2 复方黄柏液对家兔耳部皮肤切除性伤口肉芽组织TGF-β1、FGF7和VEGF表达的影响 与对照组相比，各剂量复方黄柏液可不同程度促进家兔切除性伤口的愈合，使创口肉芽组织中FGF7、VEGF表达增加(P<0.05，P<0.01)，但对创口肉芽组织TGF-β1表达作用不明显，差异无统计学意义。见图1，表2。

图1 复方黄柏液对家兔耳部皮肤切除性伤口肉芽组织TGF-β1、FGF7和VEGF表达的影响Fig.1 Effect of FFHB liquid on TGF-1β and VEGF and FGF7 expression in granulation tissue of rabbit ear skin excision wound healing

组别剂量(mL/处创口)例数TGF-β1FGF7VEGF对照组-6109.4±41.064.8±19.642.0±15.1复方黄柏液组0.3697.4±20.0116.0±30.3**89.7±31.0*0.2691.1±59.3130.0±55.4*69.6±16.8*0.16113.4±49.4123.5±53.4*86.2±40.6*京万红组0.2g694.7±27.3140.2±28.6**96.3±43.3*

*P<0.05，**P<0.01，与对照组相比较，compared with control group

3 讨论

创伤愈合，是医学研究中的重要课题，肉芽组织形成数量的多少与质量的好坏直接影响创面的修复程度。创面的修复过程是一个复杂的生物学过程，研究表明多种生长因子，如成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)和转化生长因子β(TGF-β)等在组织修复过程中发挥着重要作用——刺激上皮细胞迁移、增殖以及促进角质细胞分层和分化，是创面愈合的重要因素[3]。

FGF家族由23个成员组成，主要由角质细胞，成纤维细胞，血管内皮细胞，平滑肌细胞，软骨细胞和肥大细胞分泌，FGF-7是该家族重要的一员，多种组织的损伤会上调FGF-7的表达，FGF-7诱导表达主要通过激活蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)及环磷腺苷依赖的蛋白激酶途径完成。角质化细胞通过释放IL-1β 调整成纤维细胞FGF-7 表达，IL-1β 是最有效的成纤维细胞FGF-7诱导物[4]。FGF-7在急性创伤后表达增加，其高水平表达与伤口恢复时间一致，他加快了上皮细胞增殖和上皮化的速率，能明显刺激角质细胞增殖和迁移从而促进再上皮化[5]；同时，FGF-7还能增加对活性氧(ROS)解毒物质的转录，如非硒依赖性谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化物还原酶Ⅵ、核呼吸因子2 和肺部表皮型脂肪酸结合蛋白等，从而降低角质细胞的凋亡，通过保护角质细胞起到促进上皮化的作用[6-8]；此外FGF-7还能促进内皮细胞的增殖以及上调血管内皮生长因子(VEGF)表达，对新生血管形成起到一定的作用。VEGF的转录和分泌在急性创伤的早期增加。创伤形成后，活化的血小板、巨噬细胞在创面愈合中释放VEGF，促进血管内皮细胞的增殖和迁移，加速肉芽的生长，同时能诱导表皮基底细胞移行，加速创面的上皮化[9-11]。本研究表明复方黄柏液可不同程度增加创口肉芽组织中VEGF、FGF-7的表达，提示复方黄柏液可促进创伤局部血管增生，使创面局部的微循环得以重建，增加局部血流量，促进肉芽组织增生，并通过FGF-7的作用，促进创面组织再上皮化，进而促进伤口愈合。

转换生长因子-β (TGF-β)是一种多效性的细胞因子，主要由巨噬细胞，角质细胞，成纤维细胞和血小板分泌，在细胞增殖、细胞迁移、细胞存活和凋亡、免疫调节、上皮-间质细胞转换(epitheial-mesechymal transition，EMT)、细胞外基质生成、炎症等创伤修复期的多个生物学过程中起重要作用[12-13]。人皮肤组织中转化生长因子β有β1、β2、β3三个亚型，均可刺激结缔组织生长因子的表达，其中转化生长因子β1可促进创面早期愈合，对于创面愈合的结局具有重要意义[14]。创伤形成后，随着转化生长因子β在各细胞中表达增强，VEGF在细胞中的表达也明显增强，从而促进血管内皮细胞的增殖和迁移，加速肉芽的生长，加速创面的愈合[15]。本研究结果表明复方黄柏液促进肉芽组织中TGF-β1的表达增加作用不明显，这可能与模型动物创伤形成后局部损伤组织TGF-β1表达均显著增加有关。

综上所述，复方黄柏液具有明显的促进皮肤伤口愈合的作用，其作用机制可能与复方黄柏液促进肉芽组织的生长，促进创面组织再上皮化有关。

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(编校：吴茜)

Effect of Fufang Huangbai Ye on granulation tissue hyperplasia of rabbit skin wound

ZHANG Shuo-feng, JIA Zhan-hong, WU Jin-ying, DING Yan, WEI Yun, SUN jian-ningΔ

(Bejing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China)

ObjectiveTo observe the effect of Fufang Huangbai Ye(FFHB liquid) on wound healing and expression of TGF-β1, VEGF and FGF7 in granulation tissue of rabbit. MethodsUsing scalpel created rectangle wound through the skin to the level of the cartilage on the ventral aspect of each rabbit ear. Wounds had been treated with FFHB liquid 0.3,0.2,0.1 mL/d for 5 days. The coverage of granulation tissue and expression of TGF-β1, VEGF and FGF7 in granulation tissues of each group were observed and compared. ResultsFFHB liquid can increase the coverage of granulation tissue of wound and the expression of VEGF and FGF-7 in granulation tissue obviously (P<0.05,P<0.01). ConclusionFFHB liquid can promote the granulation tissue proliferation and wound healing.

Fufang Huangbai Ye;wound healing;TGF-β1;VEGF;FGF7

张硕峰，男，博士，副教授，研究方向：中药药理，E-mail：shuofengzhang@sina.com；通信作者，孙建宁，女，本科，教授，研究方向：中药药理，E-mail：jn_sun@sina.com。

R285.5

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10.3969/j.issn.1005-1678.2016.05.11