小檗碱联合环磷酰胺化疗抗小鼠Lewis肺癌作用

苗浩，庞冲，左彦珍，于海荣

(承德医学院 基础医学院，河北 承德 067000)

小檗碱联合环磷酰胺化疗抗小鼠Lewis肺癌作用

苗浩，庞冲，左彦珍，于海荣Δ

(承德医学院 基础医学院，河北 承德 067000)

目的 探讨小檗碱(berberine，BBR)联合环磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)对小鼠Lewis肺癌细胞C57BL/6小鼠皮下移植瘤的作用。方法 建立C57BL/6小鼠Lewis肺癌肿瘤模型，10 d后，将80只模型成功荷瘤小鼠随机分成4组：CON组、BBR组、CTX组和BBR+CTX组，每组20只分别接受灌胃给药，均连续给药10 d。每4天测量一次瘤体体积，测量4周截止，并绘制肿瘤体积生长曲线，同时观察70 d内各实验组小鼠生存情况，绘制生存曲线。末次给药后，眼眶取血，用ELISA方法检测小鼠血清血管内皮生长因子(VEGF)浓度。结果 与CON组、BBR组及CTX组相比较，BBR+CTX组对Lewis肺癌有较好的抑瘤效应，并能显著提高荷瘤小鼠的生存时间(P<0.05)。BBR+CTX组血清中VEGF浓度较CON组、BBR组及CTX组明显降低(P<0.05)。结论 BBR联合CTX通过降低荷瘤小鼠血清VEGF浓度，抑制肿瘤血管生成，从而产生协同抗肿瘤的作用。

小檗碱；环磷酰胺；Lewis肺癌；血管内皮生长因子

肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，近年来已成为我国城市人口恶性肿瘤死亡原因的第1位[1]。手术是治疗肺癌的主要方法，但有其局限性，患者经手术后复发转移现象仍经常发生。所以人们迫切地寻找到一种在肺癌手术切除后抑制肿瘤复发转移的方法。与传统化疗即大剂量冲击疗法相比，抗血管生成化疗(antiangiogenic chemotherapy，ACT)[2]，即小剂量、短间隙、持续化疗不仅能明显提高化疗药物的药效，而且还能明显缓解传统化疗所引起的毒副作用[3]。

小檗碱(berberine, BBR)又名黄连素，异喹啉类生物碱，是中药黄连中的主要生物碱。近年来由于其广泛的生物学效应而受众多研究者的青睐，已有治疗腹泻、高血压、糖尿病、肿瘤等多方面的临床应用[4]。Jie等[5]探讨了小檗碱对肝癌细胞系HepG2血管生成的作用。结果显示，小檗碱具有下调VEGF mRNA表达和抑制血管生成的作用，是一种肿瘤血管生成抑制剂。本实验拟将小檗碱与临床上常用的肿瘤血管生成抑制类药物环磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)联合使用对抗Lewis肺癌小鼠肿瘤，一方面，考察联用小檗碱是否可以降低环磷酰胺的用量，减轻其所带来的不良反应，另一方面，考察联用小檗碱对环磷酰胺抗肿瘤效果是否存在协同增效的作用，为低毒高效的抗癌药物的开发提供理论依据，具有较大的研究意义和开发前景。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：实验用C57BL/6雌性健康小鼠80只：6～8周龄，体质量18～22 g，购自北京实验动物中心，实验动物合格证号：SCXK(京)2007-0009。饲养观察室温度23 ℃～27 ℃，相对湿度40%～60%，消毒级饲料购自北京实验动物中心，饲养于承德医学院动物实验中心。

1.1.2 细胞株：小鼠Lewis肺癌细胞株(上海酶研生物科技有限公司)。

1.1.3 药品与试剂：环磷酰胺(CTX)每支200 mg(江苏恒瑞医药股份有限公司，产品批号：20110718)；盐酸小檗碱(上海将来生化试剂有限公司，产品批号：20150311，规格：2 g)。VEGF ELISA测定试剂盒(北京中山生物技术有限公司)。改良型RPMI-1640培养液、PBS、胎牛血清(FBS)(HyClone公司)；0.25%胰蛋白酶(Sigma公司)。

1.1.4 实验仪器：TU-1901型紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；BJ-2CD型超净工作台(上海博迅生物科技有限公司)；150i型恒温培养箱(Thermo公司)；B160A型水平离心机(河北白洋离心机厂)。91501型世达机械式游标卡尺

1.2 方法

1.2.1 Lewis肺癌细胞的培养和计数：将Lewis肺癌细胞置于RPMIl640中，于37 ℃，5%CO2条件中培养并传代，取生长良好的细胞经胰酶消化、PBS洗涤后，用细胞计数板进行计数，将细胞浓度调整至107个/mL以供注射。实验结果重复3次。

1.2.2 荷瘤小鼠模型的建立[6]：取120只C57BL/6小鼠，将细胞浓度为107个/mL Lewis肺癌细胞分别接种于每只小鼠右侧背部皮下，接种量为0.1 mL，推药后见一皮丘形成，即表明接种成功。

1.2.3 实验药物对荷瘤小鼠的抑瘤实验[7-8]：接种后第10天，当荷瘤小鼠肿瘤体积达到0.05～0.1 cm3后，将80只造模成功小鼠随机分成4组：小檗碱组(BBR组)、环磷酰胺组(CTX组)、小檗碱联合环磷酰胺组(BBR+CTX组)、对照组(CON组)，每组20只。其中BBR组给予小檗碱10 mg/(kg·d)灌胃；CTX组给予环磷酰胺30 mg/(kg·d)灌胃； BBR+CTX组给予环磷酰胺30 mg/(kg·d)+小檗碱10 mg/(kg·d)灌胃；CON组给予等体积0.9%NaCl注射液灌胃，灌胃体积约0.4 mL。所有实验组均每天给药1次，连续给药10 d。自第一次给药后每4天测量一次小鼠瘤体长径和短径(每组取5只小鼠)，测量4周截止。计算瘤体积(应用公式：体积=0.53×短径2×长径，cm3)，绘制肿瘤体积生长曲线。同时观察小鼠自接种开始70 d内的生存情况，绘制生存曲线。实验结果重复3次。

1.2.4 血清VEGF浓度检查[9]：末次给药24 h后, 每组取5只小鼠经眼眶取血约0.5 mL，置于无菌干燥管内，室温放置20 min，待析出血清后，1500 r/min离心20 min后取上清液置于无菌管内，-20 ℃保存，3 d内检测。采用酶联免疫吸附法(ELISA)，检测血清中VEGF的浓度，实验步骤严格遵循试剂盒说明书进行操作。实验结果重复3次。

2 结果

2.1 肿瘤生长曲线 在细胞接种后的第10天，各组C57BL/6小鼠均可见肿瘤形成，然后各组小鼠分别接受不同药物或0.9%NaCl注射液的治疗，并于给药后的第4、8、12、16、20、24、28天测量肿瘤体积大小(每组取5只)，并绘制肿瘤生长曲线(见表1、图1)，从接种第14天开始，lewis细胞进入快速增殖期，随着时间的增长，小鼠肿瘤体积越来越大，与对照组相比，CTX组和BBR+CTX组肿瘤生长速度缓慢，在治疗后的第28天，4组小鼠的肿瘤体积差异有统计学意义(P<0.05)，CTX组、BBR+CTX组小鼠的肿瘤体积显著小于COX组，差异有统计学意义(P值分别为0.0196和0.007)；并且BBR+CTX组小鼠肿瘤体积较CTX组更小，2组差异显著(P=0.039)。

表1 各组小鼠经治疗后不同时间点的肿瘤体积Tab.1 The tumor volume of different time points of mice in each group after treatment(±s)

*P<0.05，与CON组比较，compared with CON group；#P<0.05，与CTX组比较，compared with CTX group

图1 肿瘤生长曲线Fig.1 Tumor growth curve(±s)

2.2 荷瘤小鼠生存曲线 各组C57BL/6小鼠自接种后观察70 d，统计生存时间，得到各组中位生存期和95%置信区间(见图2、表2)。BBR组和CTX组与CON组平均生存期比较差异无统计学意义(P=0.9889、P=0.2844)。BBR+CTX组平均生存期与CON组比较显著提高(P=0.0005)，表明CTX联合BBR应用可显著提高肿瘤小鼠的生存期，达到协同抗肿瘤的作用。

图2 小鼠的生存曲线Fig.2 Mice survival curve

组别平均生存期中位生存期95%置信区间下限上限CON组42.05±2.574137.0147.09BBR组43.60±2.314139.0748.13CTX组45.60±2.554340.6150.59BBR+CTX组55.45±2.695750.1760.73

2.3 小鼠血清中VEGF表达值 由表3可知，4组血清VEGF浓度比较差异有统计学意义(P<0.05)，与CON组比较，BBR组血清VEGF浓度有降低的趋势，但差异无统计学意义(P=0.269)，CTX组、BBR+CTX组血清VEGF浓度降低，差异有统计学意义(P=0.002、P=00048)；与CTX组比较，BBR+CTX组血清VEGF浓度明显降低，差异有统计学意义(P=0.039)。

表3 小鼠血清VEGF浓度比较Tab.3 Serum VEGF concentration in mice(±s)

*P<0.05，与CON组比较，compared with CON group；#P<0.05，与CTX组比较，compared with CTX group

3 讨论

肺癌患者的病死率较高，且常用化疗药环磷酰胺毒副作用较大，因此，寻找协同CTX减轻其毒性的药物是肺癌联合化疗的重要研究方向[10-11]。为研究小檗碱能否有协同增效环磷酰胺对小鼠Lewis肺癌的抑制作用，本课题组首先建立Lewis肺癌细胞C57BL/6小鼠移植瘤模型。各组C57BL/6J小鼠在细胞接种后10d均可触及皮下肿瘤，移植瘤形状多位圆形或椭圆形，包膜完整，与周边组织分界清楚。接下来随即将造模成功的80只荷瘤小鼠分为4组，分别接受不同方案的治疗，并在第一次治疗后第4、8、12、16、20、24、28 d对移植瘤体积进行在体测量，绘制肿瘤生长曲线。同时自接种开始70 d内观察小鼠生存情况，绘制小鼠生存曲线。结果显示，与对照组和单用组相比较，BBR联合CTX对Lewis肺癌有更好的抑瘤效应，并能显著提高荷瘤小鼠的生存时间。说明2药合用产生协同增效的作用。

肿瘤的生长发展离不开肿瘤血管生成，抑制血管生成能有效地控制肿瘤的进展，已经逐渐成为一种肿瘤靶向治疗的手段[12]。肿瘤血管生成的过程受到多种血管生成激活因子和血管抑制因子的调控，促进血管生成因子与抑制血管生成因子失衡，是促进肿瘤新生血管发生与肿瘤生长的关键因素[13]。其中，VEGF作为一种关键的、功能强大的肿瘤血管生成刺激因子发挥着中枢性的调控作用，参与多种生物学效应，与肺癌的发生发展密切相关[14]。因此本研究应用ELISA方法检测荷瘤小鼠血清VEGF浓度，结果发现，与对照组比较，各实验组荷瘤小鼠血清VEGF浓度均有不同程度降低，且BBR+CTX组更为明显(P<0.05)。因此，推测BBR联合CTX可能通过降低荷瘤小鼠血清VEGF浓度，抑制肿瘤血管生成，从而提高CTX对小鼠Lewis肺癌的抑制作用。本课题组下一步实验计划将对联合效应产生机制进行深入探索，为小檗碱协同化疗药物治疗肿瘤提供更可靠的依据。

[1] 姜彪，李积德，赵君慧，等.非小细胞肺癌治疗进展[J].社区医学杂志，2012，10(9)：10-12.

[2] Browder T, Butterfield CE, Kraling BM, et al.Antiangiogenic scheduling of chemotherapy improves efficacy against experimental drug-resistant cancer[J].Cancer Res, 2000, 60(7): 1878-1886.

[3] 于水静，张树英，邱萌，等.环磷酰胺和紫杉醇联合化疗诱导小鼠Lewis肺癌细胞的凋亡[J].华西药学杂志，2006，21(1)：43-44.

[4] 李波，朱维良，陈凯先.小檗碱及其衍生物的研究进展[J].药学学报，2008(8)：773-787.

[5] Jie S, Li H, Tian Y, et al.Berberine inhibits angiogenic potential of Hep G2 cell line through VEGF down-regulation in vitro[J].J Gastroenterol Hepatol, 2011, 26(1): 179-185.

[6] 李春杰，孙建立，刘苓霜，等. 益气养阴方抗C57小鼠Lewis肺癌转移作用与调节MMP-9、TIMP-1蛋白表达的实验研究[J]. 上海中医药杂志，2009, 43(6)：63-67.

[7] Wigginton JM, Lee JK, Wiltrout TA, et al.Synergistic engagement of an ineffective endogenous anti-tumor immune response and induction of IFN-gamma and Fas-ligand-dependent tumor eradication by combined administration of IL-18 and IL-2[J].J Immunol, 2002, 169(8): 4467-4474.

[8] 陈湘琦，林挺岩，李志鹰，等.白细胞介素-18对Lewis肺癌小鼠肿瘤增殖及微血管生成的抑制作用[J].中国癌症杂志，2009(1)：17-20.

[9] Mujagic E, Gianni-Barrera R, Trani M, et al.Induction of aberrant vascular growth, but not of normal angiogenesis, by cell-based expression of different doses of human and mouse VEGF is species-dependent[J].Hum Gene Ther Methods, 2013, 24(1): 28-37.

[10] 王锐，姜小军，郑婕，等.氧化苦参碱增强环磷酰胺对小鼠Lewis肺癌生长的抑制作用[J].第二军医大学学报，2008，29(4)：399-403.

[11] Lechat P.Pharmacological Basis for Therapeutics.Pharmacological Analysis of Summary of Product Characteristics (SPC) for Physicians[J].Therapie, 2015, 70(5): 403-414.

[12] 王刚，程雪，张祥林, 等.shRNA-CXCR7联合TRAIL对人肝癌SMMC-7721细胞裸鼠皮下移植瘤生长的影响[J].中国生化药物杂志，2016，1(36)：28-31.

[13] Llovet JM.Focal gains of VEGFA: candidate predictors of sorafenib response in hepatocellular carcinoma[J].Cancer Cell, 2014, 25(5): 560-562.

[14] Yang Y, Maimaitiyiming X, Jin C, et al.Influence of Heparanase and VEGF-C mRNA Expressions in Lung Cancer[J].Indian J Surg, 2015, 77(6): 477-480.

(编校：王俨俨)

Inhibit of berberine combined with cyclophosphamide on Lewis pulmonary carcinoma in mice

MIAO Hao, PANG Chong, ZUO Yan-zhen, YU Hai-rongΔ

(College of Basic Medicine, Chengde Medical University, Chengde 067000, China)

ObjectiveTo investigate the effect of berberine (BBR) combined with cyclophosphamide (CTX) on the growth of Lewis pulmonary carcinoma in the C57BL/6 mice.MethodsThe subcutaneous transplanted tumor model of Lewis cell in C57BL/6 mice was established.After 10 days, the 80 mice models were randomly divided into four groups (n=20).CON group, BBR group, CTX group and BBR+CTX group that

intragastric administration therapy respectively lasting for 10 days.The tumor sizeinvivowas measured every 4 days lasting for 4 weeks and the growth curve of transplanted tumor was drawed.Meanwhile, the survival of mice within 70 days was observed, then drawing survival curve.After the last administration, took 5 mice from each group for drawing blood, then serum VEGF concentration of mice was detected by ELISA.ResultsCompared with CON, BBR or CTX group, the BBR+CTX group showed better antitumor effect, and increased the survival time of model mice significantly (P<0.05).The serum VEGF concentration in BBR+CTX group decreased significantly than CON, BBR and CTX group (P<0.05).ConclusionBBR combined with CTX could significantly inhibit the growth of Lewis cell tumor in C57BL/6 mice through reducing the serum VEGF concentration.

berberine; cyclophosphamide; Lewis lung cancer; vascular endothelial growth factor (VEGF)

河北省教育青年基金(2014036)；承德医学院自然科学项目(201510)

苗浩，男，硕士，助教，研究方向：中药药理研究，E-mail: miaohao_1986@126.com；于海荣，通信作者，女，硕士，副教授，研究方向：中药药理研究，E-mail: 2821978755@qq.com。

R322.35

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.05.10