核酸适体的筛选及其在生物医学领域的研究进展

靳贵晓，李娟，杨黄浩

(1.福建工程学院生态环境与城市建设学院，福建福州350118; 2.福州大学化学学院，食品安全分析与检测教育部重点实验室，福建福州350116)

核酸适体的筛选及其在生物医学领域的研究进展

靳贵晓1，李娟2，杨黄浩2

(1.福建工程学院生态环境与城市建设学院，福建福州350118; 2.福州大学化学学院，食品安全分析与检测教育部重点实验室，福建福州350116)

核酸适体是由指数富集配体系统进化技术(SELEX)筛选获得的能够与靶标物质特异性、高亲和力结合

的单链DNA或RNA.能够被核酸适体识别的靶标物质包括各种小分子物质、大分子蛋白质、细胞等，广泛应用于生物医学研究各领域.为此，对核酸适体的筛选制备技术、对生物医学靶标物质的检测方法以及在疾病的靶向诊断和治疗中的研究进展进行了综述，并对其在生物医学领域中的应用进行了展望.

核酸适体;指数富集配体系统进化技术;传感检测;靶向诊断;治疗

0 引言

1990年，美国研究者Tuerk和Gold［1］通过体外筛选并结合PCR核酸扩增技术，从RNA随机文库中首次获得了能够与噬菌体DNA聚合酶特异性结合的RNA序列，并将该筛选方法命名为指数富集配体系统进化技术(system evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX).随后，Ellington和Szoatak［2］两位研究人员又利用SELEX技术筛选得到了能够特异识别结合染料小分子的RNA寡核苷酸序列，并将其命名为“Aptamer”核酸适体，从此核酸适体受到研究者的广泛关注.核酸适体可以分为两种类型:DNA核酸适体和RNA核酸适体，长度通常为25～60个核苷酸.核酸适体能够识别、结合的靶标物质范围非常广泛，包括酶、生长因子、基因调节蛋白、植物凝集素、细胞粘附分子，甚至是完整的细胞、病毒等［3］.经过研究发现，核酸适体可以折叠成一定的三维空间立体结构，比如:假结(pseudoknot)、发卡(hairpin)、G－四链体(G－quadruplex)、鼓包(bulge)等，核酸适体的这些特殊位点能够与靶标物质通过静电作用、氢键作用、堆积作用、疏水作用和形状匹配等多种相互作用力形成嵌合或包被的高亲和力复合物，从而实现对靶标物质的特异性识别结合［4］.部分RNA核酸适体与靶标物结合后的Kd值甚至可以达到pmol·L－1级别［5］，表明部分核酸适体与靶标物质的亲和力要优于抗体与抗原的结合［6］.并且能够严格区分只有一个基团差别的靶标分子与其他非靶标分子［7］或旋光性不同的氨基酸［8］，具有良好的特异性.此外，核酸适体还具有无免疫源性、合成简便、稳定性好、易修饰等优点［9］，因此，自发现以来便受到研究者的极大关注，已在生物传感检测［10］、成像诊断［11］、疾病的靶向治疗［12］等诸多领域得到了快速的发展.本文对核酸适体的筛选方法及其在生物医学领域的研究进展进行综述.

1 核酸适体的筛选方法

1.1 常规SELEX筛选技术

常规SELEX筛选技术由Tuerk［1］、Ellington［2］等研究者于1990年共同创建.该方法以随机寡核苷酸文库作为筛选的基础，从大量随机序列中经过反复筛选和富集，获得一条或多条与靶标物质具有较强亲和力的寡核苷酸序列.研究证明，作为筛选基础的随机寡核苷酸库的设计与核酸适体的筛选结果密切相关［13］.随机文库分为单链DNA(ssDNA)库和单链RNA库，二者具有共同的特点:库中随机核苷酸链的长度通常为25～60个碱基，链两端均设计有固定的PCR引物结合序列，链中间部分为随机序列，不同的随机序列折叠成不同的空间构象，这决定了寡核苷酸库的容量及多样性.若随机序列有n个碱基，则库容量为4n.库容量越大，筛选到优质核酸适体的机率越大，以达到不同靶标核酸适体的筛选需求.研究表明，寡核苷酸库的库容量达到1013～1015即可满足筛选需求［14］.根据实际筛选过程的不同，可以对库中的随机寡核苷酸序列的骨架或核酸配基通过有机小分子［15］、荧光染料［16］或放射性核素［17］等进行修饰以满足后期不同的需求.文库SELEX筛选过程主要包括以下三个步骤(见图1):(1)首先将靶标与寡核苷酸库混合孵育一定时间，当单链寡核苷酸遇到靶标时会发生适应性变化，形成特殊的空间三维立体结构，然后通过多种非共价作用与靶标紧密结合形成靶标－核酸复合物; (2)通过磁性分离［18］、膜过滤分离［19］、毛细管电泳［20］等多种分离方法将与靶标结合的单链寡核苷酸分离，获得初级的核酸适体;(3)再以分离获得的单链寡核苷酸作为聚合酶链式反应(PCR)的模板，进行PCR扩增，然后利用磁性分离［18］、酶切法［21］等获得PCR产物中的一条有意义链作为次级文库，用于下一轮筛选.以此方法重复筛选约9～16轮即可得到针对靶标的核酸适体，对最后一轮筛选获得的单链寡核苷酸进行测序和二级结构的预测，以评估其与靶标结合的亲和力和特异性.

1.2 改进型SELEX筛选技术

使用常规SELEX技术筛选核酸适体通常需要反复筛选9～16轮，筛选过程费时费力，并且对于各种各样不同的靶标物质，常规SELEX筛选方法有其自身的局限性.为了简化筛选过程、提高筛选的效率及自动化程度，国内外研究者在常规SELEX方法的基础上，发展了多种改进型SELEX筛选技术，如消减SELEX、加尾SELEX、细胞－SELEX、结合定量PCR的SELEX技术、结合流式细胞的SELEX技术、毛细管电泳SELEX等.

1.2.1 消减SELEX(subtractive－SELEX)技术

在核酸适体筛选的过程中，有些非特异性寡核苷酸能够与已知或未知的共有靶标物质结合导致干扰.这种情况下通常使用tRNA或亲和基质作为筛选的非特异性作用对象进行反筛，将这些非特异性寡核苷酸从随机库中除去作为次级文库，再从中进行核酸适体的筛选，该方法称为消减SELEX(subtractive－SEL-EX)技术.利用该方法能够减少靶标物质类似物的干扰，从而能以高度相似的靶分子筛选到具有较强特异性的核酸适体，所以消减SELEX技术在临床诊断和疾病的个性化治疗方面具有优势.陈桦等［23］以小鼠IgG亚型作为靶标，采用靶标替换方法进行消减SELEX筛选，通过16轮筛选，获得了与小鼠IgG不同亚型的相同部位Fc片段特异性结合的核酸适体.2013年，Wang等［24］利用消减SELEX技术经过9轮筛选得到并鉴定了6条ssDNA核酸适体，它们能够与临床高致龋性变形链球菌特异性识别结合.

1.2.2 加尾SELEX(tailored－SELEX)技术

随机寡核苷酸库中的序列设计通常包括两端的固定区和中间的随机区，固定区作为引物结合位点引发了PCR扩增，但同时也会影响随机序列的退火效果，或参与到核酸适体与靶标物质的结合中，对后续活性序列的截短造成影响.2003年，Vater等研究者［25］在寡核苷酸库的序列随机区两端设计了长度较短的固定序列，并引入接头序列与固定序列形成搭桥，PCR反应过程中引物与模板序列通过搭桥连接，与其他方法不同的是随后产生的PCR产物中的引物序列要被裂解，所以使得进入下一轮循环的寡核苷酸两端仍保持较短的固定序列.并且最终筛选获得的核酸适体只包含随机区序列，由于两端不含引物结合序列而无需进行常规的序列截短，避免了常规SELEX筛选方法带来的序列后续处理问题.Vater等［25］通过该技术成功筛选出了与降钙素基因相关多肽1(Ca－CGRP1)特异性结合的核酸适体.

1.2.3 结合定量PCR的SELEX技术

将常规SELEX筛选方法与定量PCR(qPCR)核酸扩增方法结合，利用定量PCR对每轮筛选的核酸扩增过程进行实时监测，避免过度扩增带来的浪费，保证了在较少的重复筛选次数的基础上能够获得高亲和力的核酸适体，提高了筛选的效率.Savory等［26］利用定量PCR技术对致肾盂肾炎大肠埃希菌的核酸适体SELEX筛选过程进行跟踪，经过5轮便成功筛选得到能够高亲和性结合靶标细菌的核酸适体，极大地简化了筛选过程.Yang等［27］将定量PCR与新型的单珠SELEX筛选方法结合，综合后的新方法最大的优点是对靶标物质需求量极少，全程只需要45 ng即可完成筛选，经过5轮便成功筛选到α甲酰辅酶a消旋酶的核酸适体.由于定量PCR技术灵敏度高，所以为了保证结果的特异性，需要严格控制PCR的各项条件.并且该方法对实验设备也有一定的要求.

1.2.4 混合SELEX(blended－SELEX)技术

为了减少非特异性寡核苷酸吸附带来的干扰，1995年，Drew等［28］在筛选所用的随机寡核苷酸库中加入小分子物质二苯膦酸酯衍生物，它能够促使潜在的核酸适体与靶标物质人中性白细胞弹性蛋白酶(hNE)结合.利用该方法能够更高效地筛选出靶标物质的核酸适体，被称为混合SELEX(blended－SELEX)技术.在该方法的基础上，研究者又衍生出表达盒SELEX(expression cassette－SELEX)技术.该方法的主要内容是将核酸适体序列与基因表达框设计在一起，令获得的核酸适体在体内能够通过表达框实现上调表达.Martell等［29］将E2F蛋白的核酸适体序列设计到基因表达框内，所获得的新核酸适体具有结合E2F蛋白的能力，同时又可以在体内进行高水平表达.为该核酸适体的基因水平治疗提供了新途径.

1.2.5 复合靶分子SELEX(complex targets－SELEX)技术

核酸适体筛选技术出现的早期，靶标物质往往需要预先纯化，而实际筛选时很多靶标物质不易获得，甚至靶标物质本身比较复杂或还未研究透彻(如整个细胞).在这种情况下就需要一种针对复合靶标物质的筛选方法.1998年，Morris等［30］首次以人红细胞总蛋白混合物作为靶标物质，通过复合靶分子SELEX技术在同一个库中成功筛选到针对混合物中不同靶标的核酸适体，筛选结果显示，此方法能够做到不同核酸适体间互不干扰，极大地扩展了SELEX技术的应用范围.其中，最为成功的是对肿瘤细胞核酸适体的筛选［31－32］.由于肿瘤细胞表面结构复杂，利用该技术则无需对其表面结构进行透彻研究便可将整个肿瘤细胞作为靶标物质进行核酸适体的筛选，由此衍生而来的筛选方法被称为细胞SELEX(cell－SELEX).采用细胞SELEX技术已经筛选获得了一批针对肿瘤细胞的核酸适体［33－34］，在临床疾病的诊断治疗研究中起到重要的作用.Wu等［35］利用细胞SELEX技术筛选获得针对胰腺导管腺癌细胞的核酸适体XQ－2d，以其作为信号探针通过荧光成像检测等方法对胰腺导管腺癌的临床样本检出率达到82.5%，远远超过其他核酸适体对该种疾病的检出率.前列腺癌的发病率逐年上升并引起人们的重视.Wang等研究者［36］以前列腺癌细胞作为靶标(见图2)，筛选得到核酸适体Wy－5a，该核酸适体与前列腺癌细胞株PC－3能够高亲和力、特异性地结合，而对其他类型前列腺癌细胞不具亲和力.这为激素不敏感型前列腺癌的早期诊断和治疗提供了重要途径，同时也有助于不同类型前列腺癌细胞的差别研究.然而由于细胞膜上靶分子数目过多，使得其中的低丰度靶分子不易获得其特异性的适体.Ohuchi［37］利用基因工程在哺乳动物细胞表面过渡表达重组蛋白作为靶标进行核酸适体筛选，成功获得Kd值低至nmol·L－1的核酸适体.

1.2.6FACS－SELEX技术

SELEX筛选过程中最关键的问题是如何将能够与靶标物质特异结合的核酸序列从库中有效分离出来.在细胞SELEX筛选过程中，通常采用离心的方法进行分离，但离心会破坏细胞，并且无法区分活细胞和死细胞.基于以上考虑，2008年Mayer等［38］改进了细胞SELEX技术，将活细胞和死细胞的混合液与寡核苷酸库进行孵育，再用流式细胞仪对孵育后的细胞进行分选，将分离后的核酸序列经PCR扩增形成次级寡核苷酸库，经过10轮筛选获得了针对活细胞的核酸适体.研究者将这种与流式细胞仪结合的荧光分析筛选方法称为FACS(fluorescence－activated cell sorting)SELEX技术.该方法为复杂样本中靶标细胞亚群核酸适体的快速筛选提供了可能的途径.

1.2.7 基因组SELEX(genomic－SELEX)技术

核酸适体的筛选是以靶标物质与核酸序列的相互作用为基础的.Britta等研究者［39］构建了大肠杆菌的基因组序列库，并以这种天然基因库作为核酸适体筛选的基础，从中简单、快速地筛选得到代谢调节酶的特异性核酸适体，被称为基因组SELEX.该方法的最大特点是以生物活性分子作为靶标物质，从某种生物基因库中识别出与之相互作用的序列.这对研究生物活性分子与自身基因的互作提供了一种新方法，尤其是为蛋白质等调控元件参与基因调控的原理研究提供了新颖有效的手段.为了保证筛选结果的可靠性，该方法对所建立的起始文库提出了较高的质量要求，构建的初始基因组文库必须包括全部基因的序列和全部内含子序列.2014年，Wu等研究者［40］在糖多孢菌基因组库中通过基因组SELEX技术筛选得到针对调节因子BldD的7条天然基因序列，并通过电泳分析、定量PCR分析等阐明了调节因子BldD在红霉素的生产及细菌形态学分化方面的积极作用，该方法为生物体内基因调控的研究提供了新途径.

1.2.8 毛细管电泳SELEX(CE－SELEX)技术

常规SELEX技术通常利用醋酸纤维素膜过滤或聚丙烯酰氨凝胶电泳等方法将结合了靶标物质的寡核苷酸与游离寡核苷酸进行分离，这些方法都存在分离介质对靶标物质或其复合物的非特异性吸附、操作过程繁琐、分离效果不理想等缺陷.而将毛细管电泳应用到SELEX筛选中恰好能够克服以上分离方法的缺点，被称为毛细管电泳SELEX.分离的原理是根据靶标物质及其复合物或游离寡核苷酸序列在毛细管电泳的高压电场中具有不同的荷质比，令各组分的电泳迁移率不同而实现分离.该方法不引入分离介质，具有极高的分离效率，分离快速，所需样品量很少，成本低.通常经过2～4轮即可筛选到高亲和力的核酸适体.Eaton等［41］利用毛细管电泳SELEX筛选得到针对卵巢癌标志物HE4的核酸适体，区别于常规SELEX筛选方法的PCR扩增及测序环节，进一步利用高通量的测序方法对核酸适体进行测序，并通过生物信息学在线数据库对核酸适体进行对比分析，为核酸适体的快速、大量筛选提供了新思路.Brito等［42］通过毛细管电泳SELEX筛选获得了微囊藻毒素的核酸适体，筛选周期短，所需靶标物质微囊藻毒素的量少，这为水样微囊藻毒素检测传感器的构建奠定了基础.但毛细管电泳SELEX技术也存在一定的缺陷，主要表现为进样体积小(nL级)，导致文库中DNA分子的数量通常少于1013个［43］.

1.2.9 荧光磁珠SELEX(FluMag－SELEX)技术

2005年，Stoltenburg等研究者［44］将磁珠和荧光素联用，以筛选链霉亲和素的核酸适体，由此建立了荧光磁珠SELEX技术.该方法的特点是以磁珠作为固定相固定靶标物质，与寡核苷酸库孵育后利用磁场对磁珠的吸附将游离寡核苷酸和复合物快速分离，分离过程操作简便.对洗脱的特异性吸附序列通过PCR扩增库再投入下一轮筛选.Kumar等［45］研究者将小分子物质尿素作为靶标通过缩合反应连接到磁珠表面，以荧光磁珠SELEX方法从ssDNA库中通过8轮筛选获得了尿素的高亲和性核酸适体U38.并以U38修饰金纳米粒子(AuNPs)制备出无需信号标记的尿素检测传感体系.Huang等［46］以荧光磁珠SELEX方法经过12轮筛选获得了金黄色葡萄球菌毒素A的核酸适体A15，该核酸适体与靶标毒素的解离常数达到48 nmol·L－1，以其制备的荧光传感检测体系对金黄色葡萄球菌毒素A的检测限达到8.7 ng·mL－1.然而，最初的荧光磁珠SELEX筛选过程大部分需要人工操作，在自动化方面有待提高.

1.2.10 自动化SELEX(automated－SELEX)技术

常规SELEX筛选过程往往需要人工操作9～16个循环，费时费力，效率低.Cox等［47］在Beckmann－CoulterBiomek 2000 Pipetting系统的基础上，经过整合和改进，于1998年成功研制了第一个自动化SELEX筛选工作站，主要机理是将靶标物质通过链霉亲和素－生物素作用固定到磁珠表面，利用类似于荧光磁珠SELEX的方法结合已设定的RT－PCR程序进行自动筛选.经过12轮筛选首次得到溶菌酶的核酸适体.随后，Eulberg等［48］和Hybarger等［49］又对该平台进行完善，实现了自动筛选过程的实时在线监控.2009年，Lou等研究者［50］又将微流控芯片整合到自动化SELEX筛选平台(见图3)，在微流通道中植入磁性装置，实现磁性微球的自动化精准控制.该方法被称为微流控制SELEX(microfluidic－SELEX)技术，通过一轮筛选便获得了特异性核酸适体.自动化SELEX极大地提高了筛选速度，降低了筛选成本，克服了人为操作导致的不利因素，实现了对核酸适体的高通量筛选，所以是未来的发展趋势.

2 核酸适体在生物医学检测中的应用研究

2.1 核酸适体对小分子物质的检测

生命有机体的生理代谢活动与各种小分子物质密切相关，比如各种金属离子、三磷酸腺苷(ATP)等.因此对小分子物质进行检测并分析是生物医学研究的重要内容.研究者利用小分子靶标物质的核酸适体作为识别元件构建荧光传感、电化学传感等检测体系实现了对生物医学小分子物质的快速、灵敏检测.

Disar等［51］以As(Ⅲ)离子的核酸适体修饰银纳米粒子形成Apt－SNPs复合物(见图4(a))，当出现As(Ⅲ)离子时，它能够引起Apt－SNPs复合物的聚集，从而导致银纳米粒子在403 nm处的光吸收显著减弱，该比色传感检测体系对As(Ⅲ)离子检测限达到6 μg·L－1，具有很高的灵敏度和特异性.Guo等［52］将黄连素的核酸适体序列与G－四链体序列巧妙地设计在一起(见图4(b))，当K+存在于体系中时，它能够与黄连素－核酸适体复合物结合，进一步增强黄连素的荧光强度，利用这种方法构建了一种简单的免标记荧光增强型核酸适体传感体系，对K+的检测限达到31 nmol·L－1，并具有较宽的线性检测范围(0～1 600 μmol·L－1).除了体外样品中金属离子的检测，对于活细胞内离子含量的检测也是研究活细胞生理活动的重要内容和难点所在，这对检测方法提出了很高的要求.Yang等［53］发展了一种活细胞内K+的可视化检测方法(见图4(c)).他们将K+的核酸适体(G－四链体)通过与互补序列(cDNA)结合，修饰到金纳米粒子(AuNPs)表面.当K+存在时，核酸适体与K+结合从而脱离金纳米粒子表面，并且在K+的作用下核酸适体构象发生变化，其两端的荧光基团靠近，引发了强烈的荧光共振能量转移(FRET)，从而出现明显的荧光增强.细胞成像实验表明该比率型荧光传感检测体系可用于活细胞内K+的检测.除了金属离子之外，Li等［54］以微囊藻毒素核酸适体修饰于AuNPs表面，微囊藻毒素能够与核酸适体结合从而脱离AuNPs表面，导致AuNPs发生聚集，等离子体共振吸收峰发生蓝移，从而实现对微囊藻毒素的快速检测，检测限达到0.37 nmol·L－1.Eissa等［55］通过SELEX技术首次筛选出来双鞭甲藻毒素的高亲和力核酸适体(Kd=42 nmol·L－1)，并以其构建了一种基于竞争性结合的电化学生物传感器以检测双鞭甲藻毒素，为该毒素的快速检测提供了有效的方法.

为了实现对痕量物质的超灵敏检测，研究者又采取了多种信号放大的方法用于传感器的构建，常用的有酶切循环放大技术、寡核苷酸链置换技术、序列扩增等.Zhu等［56］发展了一种酶切循环放大体系，原理是利用核酸适体和两条DNA辅助链构建聚丙烯酰胺水凝胶，同时将金－铂纳米粒子(Au@PtNPs)包裹在其中，当遇到目标物质时，核酸适体与靶标物质结合导致水凝胶中Au@PtNPs释放出来，并催化H2O2产生O2，通过O2推动芯片通道中红墨水的移动距离对靶标物质进行定量检测.Au@PtNPs催化反应具有循环放大效应，利用该体系实现了对可卡因的快速、定量检测，检测限为60 pmol·L－1，为新型即时检测设备的研发奠定了基础.

本实验室Liu等［57］通过偶联程序化的毛细管核酸适体传感器，CdS纳米粒子标记的DNA信号序列对作为信号放大机制，设计了一种能够超灵敏检测ATP的电化学传感平台(见图5).该系统由流动进样器、毛细管孵育系统和国产的电化学池构成.ATP核酸适体将捕获探针和信号探针相连接，当靶标物质ATP出现时，核酸适体与ATP识别结合，从而将信号探针释放出来，利用溶出伏安法监测电流的变化，从而实现了对小分子物质ATP的检测.以CdS纳米粒子标记的双链DNA作为放大技术比传统的信号放大方法更灵敏，检测限低至3 pmol·L－1，且改进后的该检测系统有望实现分析的全自动化.

2.2 核酸适体对大分子物质的检测

生命活动离不开各种各样的蛋白质酶类、生长辅助因子等大分子物质，其中某些大分子物质比如肿瘤标志物，还与肿瘤的发生、发展以及预后监测密切相关，所以开展大分子物质的检测对于研究生命代谢活动及疾病的发展进程具有重要意义.

目前，已查明的肿瘤标志物大约有上百种，研究者通过SELEX技术已经有针对性地筛选出部分肿瘤标志物的核酸适体［58］，并以核酸适体为识别元件构建了一系列肿瘤标志物检测传感体系［59］.这对于肿瘤的早诊断、早发现、早治疗及预后效果评估都具有重要的意义和参考价值.Ma等［60］将上皮肿瘤标记粘蛋白1(MUC1)核酸适体固定于金电极表面，在核酸适体末端连接电化学信号标记，MUC1与核酸适体特异性结合后会引发电信号的显著变化，对MUC1的检测限为50 nmol·L－1，与传统的商品化ELISA检测试剂盒相比，该方法具有更高的灵敏度，为MUC1的临床检测提供了新方法.与常规的电化学或荧光检测方法不同，Zheng等［61］以磁控溅射技术组装了一种新型的基于ZnO的薄膜腔声波谐振器作为生物传感器检测MUC1.链霉亲和素在薄膜表面自组装，生物素标记的MUC1核酸适体通过Au－S键连接到AuNPs表面作为靶标捕捉元件，体系中存在靶标物质MUC1时，核酸适体空间结构发生变化从而暴露出生物素，AuNPs便可以通过生物素－链霉亲和素的相互作用连接到薄膜表面，引发了薄膜腔声波谐振器的共振频移，频移与MUC1浓度呈特定关系.生物素－链霉亲和素结合体系的加入令该传感器具有灵敏度高、特异性好的优点.

随着纳米材料的不断发展，研究者又利用纳米材料之间的特殊互作效应构建传感体系检测肿瘤标志物，实现了免标记的信号放大过程.Wu等［62］利用前列腺特异性抗原(PSA)核酸适体及其互补序列将CdSe@ZnS量子点(QD)连接到金纳米棒(AuNR)周围形成类似卫星的结构(见图6(a))，QD荧光被AuNR淬灭.当体系中存在靶标物质PSA时，它能够与互补序列竞争结合核酸适体，从而导致QD脱离AuNR，上清液中600 nm波长处QD的荧光显著增强.对PSA的检测限达到0.029 amol·L－1.并利用该体系实现了血清样品中PSA的超灵敏检测，在更换核酸适体后又可以对其他靶标物质进行检测，具有广泛的通用性.癌胚抗原(CEA)作为肿瘤标志物被广泛应用于结直肠癌、胰腺癌、胃癌和宫颈癌等临床诊断.Pan等［63］发展了一种基于核酸适体的新型电泳微芯片分析技术，用于血清样品中CEA的检测(见图6(b)).他们以磁珠(MBs)作为固定载体，CEA核酸适体及其互补序列被修饰于MBs表面，靶标物质与核酸适体的结合导致游离互补序列的出现，该互补序列与荧光染料FAM标记的辅助DNA序列再次结合，并引发核酸内切酶对辅助DNA序列的切割.酶切反应释放出来的游离互补序列又可以引发下一轮酶切反应，导致持续释放出大量的FAM标记的DNA片段.通过电泳微芯片可以将FAM标记的DNA片段分离出来并进行荧光检测.该体系对血清CEA的检测限为68pg·mL－1，且具有良好的线性检测范围，是一种快速检测肿瘤标志物的方法，并有望进入临床应用.

核酸适体由SELEX过程筛选而来，所以针对同一靶标的核酸适体往往不止一条，选择其中两条与靶标结合力强的核酸适体可以构建针对靶标物质的“三明治”夹心结构检测体系.Zhu等［64］利用磁性微球的磁力优势，选择血小板衍生生长因子PDGF－BB核酸适体中结合力较强的两条分别修饰到磁性微球表面形成夹心结构(见图7(a))，以磁力将“三明治”夹心结构固定于电极表面，第二条结合于靶标物质的核酸适体带有电致化学发光(ECL)信号探针，以此方法实现了对靶标物质的超灵敏检测.该方法极大地简化了实验过程，对PDGF－BB的检测限低至0.08 fmol·L－1.

实现痕量物质的超灵敏检测一直是重要的研究方向.Wang等［65］报道了一种新型的ECL传感器检测凝血酶(见图7(b))，其原理是将CdS量子点修饰到玻碳电极表面作为ECL信号物质，其上再连接核酸适体和AuNPs，发现检测过程中AuNPs发生表面等离子体共振(SPR)，并同CdS之间发生能量传递，导致ECL信号大幅度增强.当核酸适体与待检测的凝血酶结合后，AuNPs脱离电极表面，致使ECL信号减弱.与传统的酶切循环信号放大方法不同，该传感器虽然属于信号减弱型，但是灵敏度极高，与之前的检测方法相比，使凝血酶的检测限降低两个数量级，达到26 amol·L－1.

Zhao等［66］利用具有表面增强拉曼散射(SERS)性质的材料pNTP包裹到Au－SiO2核壳材料的中空层形成复合体(Au－pNTP－SiO2)(见图7(c))，在Au最外层修饰溶菌酶核酸适体，它能够与指纹中广泛存在的溶菌酶结合，通过SERS成像技术对指纹进行可视化成像.该方法保证了pNTP不受外界环境的影响，提高了SERS成像的稳定性，全程无需前处理或后处理，对各种指纹均有良好的成像效果.

将检测过程自动化、微型化是分析化学研究的重要目标，也是增强检测方法稳定性和实用性的关键环节.Wang等［67］利用单个流感病毒的通用型核酸适体和金纳米粒子结合，在不同条件下可以对不同亚型的流感病毒加以区分并检测出来.而整个过程通过一个微流控芯片即可自动完成.该微型检测系统在核酸适体的临床即时检测方面有望发挥更大作用.

2.3 核酸适体对肿瘤细胞的检测

以完整的肿瘤细胞作为靶标，通过cell－SELEX技术筛选出针对不同种类肿瘤细胞的核酸适体，比如T细胞白血病、B细胞淋巴瘤、肝癌［68］等，进一步以肿瘤标志物核酸适体作为识别元件构建了大量的靶细胞检测传感体系，对肿瘤细胞进行定量检测，成为肿瘤诊断的重要辅助方法.Cai等［69］制备了一种新型的信号放大型电化学核酸适体传感器检测乳腺癌细胞(见图8(a)).首先，乳腺癌细胞核酸适体与互补序列连接到磁性微球表面，当存在靶标细胞时，核酸适体与靶标细胞结合然后释放出游离的互补序列，同时该序列具有脱氧核酶(DNAzyme)的催化功能，在Mg2+协助下发挥酶催化作用将电极表面预连接的核酸序列循环切割，产生大量的短链核酸，导致电化学信号极大降低，对乳腺癌细胞的检测限为47 cells/mL.该方法与传统的细胞检测方法相比较具有诸多优点，比如传感体系制备及操作过程简单、成本经济低廉、无需其它信号标记等.Chen等［70］还报道了一种“非典型”核酸适体夹心ECL传感器.他们以植物凝集素修饰的金纳米粒子代替夹心结构中的第二条核酸适体，同时引入碱性磷酸酶催化机制，使得该传感器对肿瘤细胞的检测限低至38 cells/mL，并且实现了复杂样品中肿瘤细胞的超灵敏检测.

Chandra Ray课题组［71］基于纳米材料“金爆米花”具有很强的表面增强拉曼散射(SERS)作用，构建了肿瘤细胞的检测体系(见图8(b))，利用表面增强拉曼散射检测方法对前列腺癌细胞实现了超灵敏检测，检测限低至50 cells/mL.并且“金爆米花”在激光的照射下可以进一步用于肿瘤的光热治疗，并对治疗过程动态进行原位监控.为肿瘤可控治疗方法的发展提供了思路.

循环肿瘤细胞(CTCs)对于肿瘤的临床诊断、转移及预后都具有重要的意义，由于CTCs在循环系统中的含量少，并且实际检测样本成分复杂，所以开展对循环系统中CTCs的检测存在很大困难.Zamay等［72］首次以手术切除的肺癌组织中分离而来的肿瘤细胞作为靶标，通过cell－SELEX技术原位筛选得到特异的核酸适体.然后以荧光染料标记的核酸适体检测到了血液样品中的靶标肺癌细胞，该检测方法的敏感度达到86%，特异性达到76%，远远优于以单一抗体检测CTCs的传统方法.后期还可以大量合成该核酸适体用于肿瘤后续治疗，为肿瘤诊疗方案的个性化定制提供了一种行之有效的方法.

3 核酸适体在疾病靶向诊疗中的应用研究

3.1 靶向诊断中的应用研究

传统的疾病诊断以生化指标检测、影像学、组织切片观察等方法为主，然而对于肿瘤等某些疾病的诊断，由于技术原因使得传统诊断方法存在一定的局限性，比如灵敏度不高、空间分辨率低、检查过程增加患者痛苦等.此时，靶向诊断技术的优势便凸显出来.鉴于核酸适体具有靶标多样化，较高的亲和力和特异性，良好的生物相容性及稳定等优点，与传统诊断方法相比较，在多种疾病的靶向诊断中具有极大的优势.

某些纳米材料，比如金属纳米粒子等，由于具有荧光效应、超顺磁性等特殊性质，研究者将核酸适体通过π－π堆积作用、共价键等方式连接到纳米材料表面，赋予了该纳米材料靶向进入肿瘤细胞的能力，将其注射至动物体内，在核酸适体的靶向介导作用下实现了对活体肿瘤的荧光成像［73］及磁共振成像(MRI)［74－75］诊断，或进一步与放射性核素联合用于正电子发射计算机断层成像(CT)［76］.

作为一种重要的非侵入性成像方式，荧光成像以其良好的灵敏度和特异性受到研究者的广泛关注.Chen等［77］突破以往的染料选择惯例，以近红外荧光染料MPA标记MUC1的核酸适体，构建了两种信号探针APT－MPA和APT－PEG－MPA，并分别在体外活细胞、活体肿瘤组织及不同MUC1表达量的活体肿瘤模型中分别考察信号探针对目标肿瘤的靶向性.结果表明，由于所选择的近红外荧光染料MAP具有更强的组织穿透力，所以成像效果好.并且核酸适体对荧光染料进入肿瘤细胞具有明显的介导作用，所以肿瘤细胞摄入速度更快，是一种非常有应用潜力的靶向荧光成像探针.

荧光成像存在易受到样本自身组织干扰这一局限性，而MRI却能够克服这一缺点，成为目前临床疾病诊断的重要手段之一.但当前常用的磁共振造影剂的灵敏度相对较低，限制了MRI方法的广泛使用.最近Li等［78］将常用的两种造影剂Fe3O4和PEG－Gd2O3通过含有二硫键的胱氨酸连接(见图9(a))，最外层以核仁蛋白特异核酸适体AS1411进行修饰，可靶向肿瘤细胞.肿瘤细胞内部过量表达的谷胱甘肽(GSH)能够将二硫键切断，从而改变Fe3O4和PEG－Gd2O3之间的距离，由此产生T1和T2信号的变化，据此对肿瘤细胞进行MRI成像.该靶向肿瘤细胞的激活型复合磁共振造影剂大大地提高了成像的灵敏度和特异性，为新型造影剂的设计提供了思路.

除此以外，PET/CT也是一种重要的的成像诊断方法，Kang等［79］将荧光染料、磁共振造影剂和放射性核素组装到SiO2纳米颗粒中(见图9(b))，以MUC－1核酸适体修饰表层，构建了一种能够靶向肿瘤组织并进行荧光成像、磁共振成像和PET成像的多模式成像剂，并且弥补了单一成像方法存在的缺点，对大多数类型的肿瘤均有效，具有一定的通用性.

3.2 靶向治疗中的应用研究

针对肿瘤等疾病治疗的药物存在药物利用率低、代谢速度快、副作用大、疗效差等缺点，而靶向给药技术可以针对病灶实现定点给药，从根本上减小副作用、提高疗效，是疾病治疗方式的重要发展方向.

核酸适体可以将基因调控过程中的参与分子作为靶标，并与之特异性结合，从而对基因表达的过程进行调节，达到疾病治疗的目的.所以核酸适体本身可以作为疾病的基因治疗药物.在肿瘤靶向基因治疗方面，核酸适体的调节作用可以归纳为四点:(1)抑制与肿瘤细胞粘附入侵相关分子的基因表达;(2)增强肿瘤免疫系统;(3)通过抑制激酶、磷酸酶等酶类的转录阻断肿瘤细胞的信号通路［80－81］;(4)与肿瘤发展过程中的相关蛋白识别结合阻止其功能的发挥［82］.Wan等［83］将人恶性胶质瘤细胞与表皮生长因子受体(EGFR)的核酸适体孵育，发现核酸适体与EGFR的结合能够阻止并抑制表皮生长因子(EGF)对受体的磷酸化，从而阻断了与肿瘤增殖和转移相关的部分信号通路，并能够促进肿瘤细胞凋亡，展现出良好的肿瘤抑制能力.该实验完全在一个仿生微芯片中进行，通过对微芯片中肿瘤细胞的观察和定量分析可以直观地判断疗效.Famulok等［84］发现特异性的核酸适体与β－连环蛋白能够结合并抑制其在结肠癌中的多重功能，有望在肿瘤的基因治疗中发挥作用.目前，国外已有核酸适体被批准应用于肿瘤的临床治疗，另有多个核酸适体正处于临床试验阶段［85－87］.在现有核酸适体结构的基础上，研究者又进一步对其修饰改造，以期构建功能性更好的核酸适体药物［88－89］，具有广阔的发展空间.

核酸适体除了自身可以作为基因治疗的药物以外，还可以与其他载体相结合，作为药物靶向运送的介导物质，在疾病的靶向治疗中起到关键的作用.将常见的核酸适体修饰的药物载体归纳后如图10所示［90］.许多肿瘤化疗药物，比如阿霉素［91］、紫杉醇［92］等，以及基因调节药物反义RNA［93］和具有治疗功能的蛋白质［94］，均可以通过共价连接或非共价连接的方式与核酸适体结合，用于肿瘤的靶向给药.

而近年来新兴的纳米材料比如石墨烯、碳纳米管等，具有尺寸小、比表面积大、易吸附单链核酸、生物相容性好、易进入细胞等优点.研究者以核酸适体作为靶向探针与石墨烯［95］、碳纳米管［96］等结合作为靶向载体，同时把肿瘤治疗药物负载于其上，将药物定向输送进肿瘤细胞，避免了药物对健康细胞的毒副作用，提高了药效.

相比于传统的化疗以及手术等方法，光热材料吸收近红外光转化为热能，利用局部高温有效杀死癌细胞，而对周边的正常组织副作用很小.这种光热疗法(PTT)正成为当今癌症治疗领域的新方向.纳米材料比如金纳米棒［97］、金－银合金纳米粒子［98］、碳纳米管［99］等均具有优良的光热性能，修饰核酸适体后常用于肿瘤靶向热疗的研究中.

在依赖核酸适体作为靶向探针的肿瘤基因治疗方面，Tan课题组［100］利用肿瘤细胞核酸适体和辅助DNA序列，通过自组装的方式制备了一种尺寸可控并且对刺激响应的纳米水凝胶，该纳米水凝胶具有良好的生物相容性，能够靶向肿瘤细胞并在细胞内GSH的作用下瓦解释放出具有基因调节功能的反义RNA和脱氧核酶(DNAzyme)，降低MMP－9蛋白的表达，从而抑制肿瘤细胞的增殖和迁移.

3.3 靶向“诊疗合一”中的应用研究

将疾病诊断和治疗分开的传统模式有其自身的局限性，随着核酸适体的发展及新型功能纳米材料的不断涌现，研究者有机会将疾病的诊断和治疗合二为一，同步进行，以期达到提高药效、改善预后、减少患者痛苦的目的，开创了靶向“诊疗合一”的生物医学研究的新模式.常见的具有靶向“诊疗合一”功能的药物载体如图11所示.

为了增强抗肿瘤药物的亲水性和生物兼容性，研究者将某些具有荧光性质的肿瘤化疗药物比如阿霉素(DOX)，负载于核酸适体修饰的石墨烯［102］、碳纳米管［103］等载体表面，对肿瘤细胞实施荧光成像诊断的同时释放药物杀灭肿瘤细胞，实现诊疗合一.而对于某些具有化疗抗药性的肿瘤细胞株，为了改善治疗效果，研究者又进一步引入具有光敏性质的药物或纳米材料，比如金纳米粒子［104］、二硫化钼［105］等，利用纳米材料的光热作用抑制肿瘤细胞的同时释放DOX实施化疗并进行荧光成像诊断.这种将光动力疗法(PDT)或光热疗法(PTT)与化疗结合的方式极大地提高了单一药物的作用效果［106］.此外，研究者还将磁共振造影剂、放射性核素和荧光染料等与化疗药物结合，发展了MRI成像－化疗［107］、CT成像－化疗［108］、荧光成像－化疗［109］等一系列诊疗合一的新方法.其中，Yuan等［110］将核酸适体与G－四连体设计在同一条序列中，并在其中嵌入光敏剂，将核酸序列修饰到具有荧光效应的上转换纳米材料NaLuF4表面，靶向进入肿瘤细胞后在激发光照射下NaLuF4产生发射光，光敏剂在发射光的作用下进一步产生单线态氧杀死肿瘤细胞.该方法能针对特定的肿瘤细胞进行成像并杀灭，具有过程可控的巨大优势.

另外一种由两亲分子组装而成的脂质体囊泡或者胶束由于其巨大的应用潜力而受到关注.此类载体最大的优势是结构单元能够通过自组装而形成载体结构，过程简单快速，自组装的同时可以在结构中心封装亲水性药物，还可以在双分子膜层之间封装疏水性药物.在具有靶向能力的胶束或囊泡中核酸适体作为结构组成的一部分，同时又是靶向肿瘤细胞的介导探针［111－112］.脂质体囊泡或者胶束能够高效地运送化疗药物进入肿瘤细胞，提高了药物利用率，减少了毒副作用.

核酸作为生命体本身所含有的物质，具有良好的生物相容性、降解性及可复制扩增的优点.近几年随着核酸扩增技术的不断发展，有研究者利用滚环扩增(RCA)等核酸扩增技术轻松制得一系列DNA聚合体，被称为“纳米火车”、“纳米花”等［113－115］，并将核酸适体结合于序列中，发展了一类新型的靶向载体，以其包裹化疗药物和荧光染料，应用于肿瘤靶向诊疗一体的研究，避免了使用纳米材料可能带来的毒性.

4 结语

核酸适体由发现至今的二十多年中，SELEX筛选技术经过不断地改进和丰富，自动化SELEX筛选系统能够将原本繁琐耗时的筛选过程缩短至一周时间，成为核酸适体筛选方法未来的发展方向.到目前为止，研究者已经筛选得到了大量针对各种靶标物质的核酸适体.各种核酸适体可以作为靶标物质识别元件，被广泛应用于生物检测与分析、临床靶向诊断与治疗、药物研发等领域.

虽然核酸适体具有诸多优点，但是与疾病常规治疗方法相比，仍有不足之处:(1)核酸适体易被降解，在体外的稳定性差，在体内的半衰期较短，尚未有通用的修饰解决方法;(2)自身透过细胞膜进入靶细胞或靶组织的效率低，往往需要借助载体;(3)大规模合成核酸适体以及核酸适体的修饰成本较高.这些都局限了核酸适体的实际应用及商品化，所以目前绝大多数的核酸适体的研究仍处于实验阶段.为了安全有效地利用核酸适体，未来有必要进一步拓展对核酸适体的研究，生化特性方面包括开展对其结构、折叠方式、靶标亲和力等的相关研究;临床应用方面开展包括其在体内的药代动力学、药效、细胞毒性、全身反应及基因调节机理等的研究.经过全面、深入的研究后，相信核酸适体一定能够成为一种便捷高效的工具，在生物医学检测及诊疗方面发挥重要的作用.

致谢:福建工程学院生态环境与城市建设学院硕士研究生王琪，在本文的撰写过程中帮助查找搜集资料，特此感谢!

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(责任编辑:洪江星，郑美莺)

Research progress of aptamer screening and its application in biomedicine

JIN Guixiao1，LI Juan2，YANG Huanghao2
(1.College of Ecological Environment and Urban Construction，Fujian University of Technology，Fuzhou，Fujian 350118，China; 2.The Key Lab of Analysis and Detection Technology for Food Safety of the MOE and Fujian Province，College of Chemistry，Fuzhou University，Fuzhou，Fujian 350116，China)

Aptamer is a kind of single－stranded DNA or RNA developed by systematic evolution of ligands by exponential enrichment(SELEX)process，which bind to the target with high selectivity and specificity，such as small molecules，proteins，whole cells，etc.The aptamer was widely used in various fields of biomedical research.In this review，the research progress of aptamer screening，detection methods of biomedical target，targeted diagnosis and treatment of disease were reviewed.And，the prospect of application of aptamer in biomedicine was discussed.

aptamer;SELEX;sensing detection;targeteddiagnosis;therapy

O6－1

A

10.7631/issn.1000－2243.2016.06.0919

1000－2243(2016)06－0919－016

2016－11－24

李娟(1985－)，副教授，主要从事生物分析和生物成像研究，lijuan@fzu.edu.cn杨黄浩(1975－)，教授，主要从事生物传感及纳米生物医药研究，hhyang@fzu.edu.cn

国家自然科学基金资助项目(21475026，U1505221，21505021，21622502，21635002);福建省自然科学基金资助项目(2015H6011，2016J05035);长江学者和创新团队发展计划资助项目(IRT15R11);能源与环境光催化国家重点实验室独立研究资助项目(2014B02)