分散固相萃取－超高效液相色谱串联质谱法测定茶叶中的7种农药残留

张桂云，杨伟强，林常青，谢建华

(1.漳州职业技术学院，农产品深加工及安全福建省高等学校应用技术工程中心，福建漳州363000; 2.漳州市产品质量检验所，福建漳州363000)

分散固相萃取－超高效液相色谱串联质谱法测定茶叶中的7种农药残留

张桂云1，杨伟强2，林常青1，谢建华1

(1.漳州职业技术学院，农产品深加工及安全福建省高等学校应用技术工程中心，福建漳州363000; 2.漳州市产品质量检验所，福建漳州363000)

以分散固相萃取技术为前处理手段，结合超高效液相色谱串联质谱法，建立一种快速检测茶叶中7种农药残留的方法.茶叶样品经前处理后，采用UPLC－MS/MS法检测分析.用空白样品提取液配制基质工作曲线，外标法定量.结果表明，多菌灵、丁醚脲、喹螨醚在0.1～2.0、灭多威在1.0～20.0、噻虫嗪、吡虫啉、噻螨酮在2.0～40.0 ng·mL－1的范围内具有良好的线性关系，其检出限为0.10～5.00 μg·kg－1.平均加标回收率为75.9%～116.8%，相对标准偏差为2.6%～6.1%.该方法简便、可靠、稳定，可用于茶叶中多种农药残留的快速检测与确证.

分散固相萃取;超高效液相色谱串联质谱;茶叶;农药残留

0 引言

我国茶文化底蕴深厚，绿茶、红茶、乌龙茶、花茶、普洱茶等品种茶叶的种植历史悠久，产量高居世界第一［1］.然而，近年来由于滥用农药引发的茶叶中农药残留超标问题极大地影响了我国茶叶的对外出口，同时也引起了人们对茶叶饮品及其相关制品食用安全的高度关注.因此，严格控制茶叶中农药的残留量，倒逼无公害化绿色茶叶生产成为我国当下亟待解决的课题.这不仅要求相关部门完善和制定严格的茶叶农药残留限量标准，而且需要建立和发展能够快速、有效检测茶叶中多种农药残留检测的分析方法，更好地满足人们对健康茶叶的要求［2－4］.

茶叶基质复杂，已知的化学成分多达数百种.目前，茶叶中农药残留常见的检测方法主要有GC、GCMS/MS、HPLC、HPLC－MS等，但对茶叶中多种农药残留的检测关键在于前处理方法的选择和优化，以去除共提取物中影响检测结果、污染仪器的成分.相比于传统的磺化法、固相萃取技术(SPE)、凝胶色谱净化技术(GPC)等前处理技术［5－6］.分散固相萃取(QuEChERS)作为一种新型的前处理技术，具有速度较快、简单方便、经济、高效、耐用和安全实用的特点，近年来被不断完善和推广应用［7－8］，但是QuEChERS与HPLC－MS－MS联用用于茶叶中农药残留的检测研究较少.其主要提取操作步骤是先在样品中加入乙腈等溶剂进行侵泡提取，然后加入无水硫酸镁和氯化钠除水，待提取液分层后，上清液经无水硫酸镁和PSA、GCB、C18、中性氧化铝等固体吸附剂除去样品提取液中的大部分非目标化合物，从而达到净化提取液的效果.相比于传统的SPE技术，分散固相萃取可以直接将吸附剂分散于提取液中，整个净化过程无需预淋洗、淋洗、洗脱等繁杂和冗长的步骤，大大节约了前处理的时间.此外，分散固相萃取可以根据基质和提取剂的性质，灵活地选择净化剂的种类和用量，对不同种类的样品净化效果更佳［9－11］.

超高效液相色谱串联质谱法(UPLC－MS/MS)结合了超高效液相杰出的分离能力和串联质谱的超高灵敏度，是一种快速发展的分析技术［12］.将其与分散固相萃取技术相结合，兼具两者的优点，可以真正实现多种农药残留的快速检测.本文探索并建立了一种以分散固相萃取技术为前处理手段，以超高效液相色谱串联质谱法为分析技术的检测方法，实现了多菌灵、灭多威、噻虫嗪、吡虫啉、噻螨酮、丁醚脲、喹螨醚［13－16］等7种农药残留的快速检测.该方法具有操作简单、快速高效、结果可靠的优点，既可以满足对茶叶中多种农药残留的定性分析，也完全可以满足定量分析的检测要求［4］.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

超高压液相色谱－质谱联用仪(Agilent 1290－6460，美国Agilent公司);涡旋振荡器(QL－861，中国其林贝尔公司);均质机(T10，德国IKA公司);高速离心机(TG16－WS，中国湘仪公司);氮吹仪(DN－24A，上海比朗仪器公司).甲醇、乙腈为色谱纯(德国Merck公司);N－丙基乙二胺(PSA)粉、石墨化炭黑(GCB)粉、无水硫酸镁、柠檬酸钠、柠檬酸氢二钠购自安谱公司;其他试剂均为分析纯;实验用水为超纯水系统(英国ELGA公司)制备.

农药标准储备液:多菌灵、灭多威、噻虫嗪、吡虫啉、噻螨酮、丁醚脲均购自农业部环境保护科研检测所，质量浓度均为100.0 μg·mL－1;喹螨醚为德国Dr固体试剂，用甲醇配制成100.0 μg·mL－1.于冰箱中4℃保存.混合标准溶液:准确移取适量的7种农药标准储备液，然后用甲醇进行稀释，使混合标准溶液中各标准品的质量浓度分别为:多菌灵0.2 μg·mL－1、灭多威2.0 μg·mL－1、噻虫嗪4.0 μg·mL－1、吡虫啉4.0 μg·mL－1、噻螨酮4.0 μg·mL－1、丁醚脲0.2 μg·mL－1、喹螨醚0.2 μg·mL－1.于4℃保存.

1.2 仪器工作条件

色谱条件:Agilent Zorbax SB C18色谱柱(2.1 mm×50 mm，1.8 mm).流动相A为乙腈，B为0.1%(体积分数，以下同)甲酸水溶液.梯度洗脱程序(以A的体积分数表示):0～0.8 min时，A为5%;0.8～2.0 min时，A由5%升至35%;2.1 min时升至75%;5.0～6.0 min时，A继续由75%升至95%;随后降至5%.流速为0.4 mL·min－1，进样量为5 μL.

质谱条件:电喷雾正离子模式电离(ESI+).电喷雾电压4 000 V;干燥气温度300℃，流量5 L·min－1;雾化气压力0.35 MPa;鞘气温度250℃，流量11 L·min－1;多反应监测模式(MRM)检测.各种农残检测的质谱参数见表1.

表17 种农药的质谱检测参数Tab.1MS parameters of 7 synthetic colorants

1.3 试验方法

称取粉碎茶样约5 g于50 mL离心管中，加入5 mL纯净水浸泡30 min.加入20.0 mL乙腈，4 g无水硫酸镁，1 g氯化钠，0.5 g柠檬酸氢二钠，1 g柠檬酸钠，涡旋振荡2 min，10 000 r·min－1离心.取上层乙腈提取液2.0 mL于预先加有20 mg PSA、10 mg GCB及200 mg无水硫酸镁的离心管中，涡旋30 s，再以5 000 r·min－1离心5 min.取上清液于40℃下氮气吹至近干，用1.0 mL甲醇－水(1∶1，体积比)溶解.经0.22 μm微孔滤膜过滤，供UPLC－MS/MS分析.以空白样品添加不同质量浓度的混合标准溶液，经该前处理方法净化，测定并绘制标准工作曲线.

2 结果与讨论

2.1 样品提取条件的优化

茶叶中含有大量的色素、有机酸、茶多酚等物质，理想的提取剂应能够最大限度地溶解目标物而减少对基质共提物的溶解.样品中农药残留的提取物有很多种，乙腈是其中一种，由于农药的极性不同，乙腈对其溶解能力也不同，且乙腈对色素的提取能力较弱，相对更适合于茶叶中多种农药残留的提取.为了提高萃取效率，在提取前加入一定量的纯水浸润干制茶叶样品，使提取溶剂与样品充分接触，然后进行提取.

很多农药对溶液的pH值敏感，控制提取溶液的pH值对提取效率有较大的影响［7］.例如，多菌灵在酸性条件下稳定，在碱性溶液中随pH值的升高分解加快.因此，对多农药残留的提取，加入合适的缓冲盐来控制提取溶液的pH值很有必要.实验通过加入柠檬酸钠/柠檬酸氢二钠将提取溶液的pH值控制在5～7范围内，减少农药残留的分解.

此外，温度也是引起农残降解的重要因素之一.均质、超声过程中产生的热量不利于农药残留的准确测定，因此，实验采用振荡提取的方式进行多农药残留的提取.

2.2 分散固相萃取吸附剂的选择

选择合适的固相萃取吸附剂净化样品是分散固相萃取的核心环节.理想的固相萃取吸附剂直接分散于提取液中，应尽可能多地吸附提取液中的干扰成分，同时尽可能多地保留待测目标化合物.常用的固相萃取吸附剂包括PSA、GCB、C18、中性氧化铝等，它们的吸附对象各有不同［7，16］.对于茶叶样品提取液，GCB可除去茶叶提取液中大部分色素，而PSA对有机酸、酚类具有很强的亲和力.因此，实验采用PSA+ GCB的组合吸附剂对样品进行净化处理.

由于固相萃取吸附剂通常为多孔物质，其对目标化合物也具有一定的非选择性物理吸附.因此，固相萃取吸附剂的用量不是越多越好，需要通过实验进行优化.各种农药残留的回收率随PSA和GCB用量增加而变化的情况见图1.从实际结果可以看出，采用20 mg PSA和10 mg GCB配比作为固相萃取的吸附剂用于样品的净化处理，效果最好，回收率最高，回收范围为85%～110%;40 mg PSA和20 mg GCB次之; 10 mg PSA和5 mg GCB效果最差.实验采用20 mg PSA和10 mg GCB配比作为固相萃取吸附剂，在保证测定结果的同时，可适当增加用量，以确保处理后的样品纯净、透明.

2.3 质谱、色谱条件的优化

实验中多菌灵、丁醚脲、灭多威、噻虫嗪、喹螨醚、吡虫啉、噻螨酮7种农药残留检测模式均为正离子模式.实验时分别测定单个农药标准品，得到其优化的质谱参数，包括检测离子对、裂解电压、碰撞能(见表1).按照1.2的色谱条件，以乙腈和0.1%甲酸水溶液为流动相，设置合适的梯度洗脱程序，即可实现7种农药的有效分离(见图2).

2.4 线性范围与检出限

由于茶叶成分复杂，其基质对质谱检测的影响较大，所以结果定量检测中，为了减小基质效应的影响，以不含农药残留的茶叶样品添加不同质量浓度的标准样品，按照前述方法进行处理得到标准工作曲线.实验结果表明，测定药物残留的质谱响应强度(y)与其质量浓度(x，ng·mL－1)在一定的范围内具有良好的线性关系(见表2)，相关系数均大于0.99.以10倍信噪比为检出限(质谱)，根据仪器给出的曲线第一浓度点的信噪比值，可以计算出多菌灵、灭多威、噻虫嗪、吡虫啉、噻螨酮、丁醚脲、喹螨醚的检出限分别为0.10、0.50、5.00、5.00、4.00、0.50、0.10 μg·kg－1.其线性方程和检出限如表2所示.

表2 线性回归方程、相关系数和检出限Tab.2Linear regression equations，correlation coefficients and detection limits

2.5 精密度和准确度

通过加标回收实验来评价方法的准确度和精密度.在前处理前，将混合标准溶液加入到5 g茶叶基质中，然后按照1.3中试验方法，进行前处理提取并测定.其中，混合标准溶液分为3个水平，每个水平平行测定6次.分析结果见表3，测得回收率为75.9%～116.8%，相对标准偏差≤6.1%，由此表明该方法具有良好的重现性，准确度和精密度良好，能够满足日常检测的要求.

表3 回收率和精密度(n=6)Tab.3Results of tests for recovery and precision

续表3

2.6 实际样品的检测

应用所建立的方法，对100份送检茶叶样品进行了检测.已累计检测出50余个含有农药残留的样品，其中检出率较高的农药为多菌灵(0.8～4.0 μg·kg－1)、噻虫嗪(100～625 μg·kg－1).

3 结论

运用分散固相萃取技术，建立一种超高效液相色谱串联质谱法用于茶叶中多菌灵、丁醚脲、灭多威、喹螨醚、噻虫嗪、吡虫啉、噻螨酮等7种农药残留的快速检测.该方法具有操作简单方便、测定快速高效、结果准确可靠的优点，提高了茶叶中多种农残留的检验效率，可应用于日常实际样品中检测，为食品质量安全检测提供了有效的技术支持.

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(责任编辑:洪江星)

Determination of seven pesticide residues in tea by dispersive solid－phase extraction and ultra performance liquid chromatography－tandem mass spectrometry

ZHANG Guiyun1，YANG Weiqiang2，LIN Changqing1，XIE Jianhua1
(1.Zhangzhou Institute of Technology，The Applied Technical Engineering Center of Further Processing and Safety of Agricultural Products，Higher Education Institutions in Fujian Province，Zhangzhou，Fujian 363000，China; 2.Zhangzhou Product Quality Supervision Institute，Zhangzhou，Fujian 363000，China)

A new method of ultra performance liquid chromatography－tandem mass spectrometry(UPLC－MS/MS)combined with dispersive solid－phase extraction as the pretreatment had been established for the analysis of seven pesticide residues in tea.The pretreated tea samples were analyzed by UPLC－MS/MS.And the matrix－matched external standard calibration curves were used for quantitative analysis.The results show that carbendazim，diafenthiuron，fenazaquin has good linear relationship in the range of 0.1～2.0 ng·mL－1，methomyl has good linear relationship in the range of 1.0～20.0 ng·mL－1，thiamethoxam，imidacloprid，hexythiazox has a good linear relationship in the range of 2.0～40.0 ng·mL－1.The limit of detection of this method was 0.10～5.00 μg·kg－1.The average recoveries of the added sample were 75.9%～116.8%with relative standard deviation of 2.6%～6.1%.The method is simple，reliable and stable，and was suited for the rapid detection and confirmation of multiple pesticide residues in tea.

dispersive solid－phase extraction;ultra performance liquid chromatography－tandem mass spectrometry;tea;pesticide residues

O657.7

A

10.7631/issn.1000－2243.2016.06.0896

1000－2243(2016)06－0896－05

2016－03－01

谢建华(1976－)，副教授，主要从事天然产物化学应用方面的研究，xiejh2001@163.com

福建省自然科学基金资助项目(2015J01356);福建省教育厅科技类资助项目(JA15690);漳州市自然科学基金资助项目(ZZ2016j25);漳州职业技术学院院级科研资助项目(ZZY1504)