药用地衣长松萝和皮果衣提取物抗鱼病真菌对比实验研究

王炳哲

研究的目的和意义

水产养殖病害的种类比较多，相关的病害防治任务就非常艰巨。目前水霉（Saprolegnia）和绵霉（Achlya）两个属中的一些种类常引起水产动物得病，通常称为水霉病。水霉病流行很广泛。在鱼类的繁殖过程当中，水霉病是最为严重的病害。

如果能通过地衣粗提液的抑菌作用，寻找出高效、天然的抗真菌药物，将会创造出很好的经济效益与社会效益。本实验选择长松萝和皮果衣这两种地衣的丙酮浸提液和松萝酸不同溶剂的溶液对几种常见鱼害真菌进行抑制的对比研究，所得的结果可为进一步研究提供参考，并为研制新的抑制病原菌药物提供信息。

实验方法

松萝酸母液及地衣粗提液的制备

松萝酸母液的制备：称取松萝酸20mg，加20mL的丙酮，摇匀，置于4℃冰箱，保存备用。

地衣粗提液的制备：取实验用地衣材料，除去杂草枯枝等杂质，分别称取2g样品剪碎或压碎，置于带磨口塞子的广口玻璃瓶中，加入30mL的丙酮，密封，摇匀，室温浸提约5h，过滤，蒸发得20mL的地衣浸提液。置于4C保温环境中，保存备用。以乙醇、乙酸乙酯为溶剂制备的浸提液方法同上。

菌株的分离培养及鉴定

鱼病相关真菌的来源：长期放养鱼类的水体、水系（岔河水系）中病鱼和观赏鱼。

鱼体分离：在超净工作台无菌环境下，用75%酒精棉球擦拭患病鱼体表2～3s，用无菌水冲洗干净，用解剖刀切取鱼背部、腹部、尾部肌肉（厚度3～4 mm），用镊子取鱼鳞片，放置于PDA培养基平板中央，每个部位做5个重复。置于25℃培养箱培养，逐日观察，直至菌丝长出后，在超净台取菌丝进行镜检，菌丝接种到PDA培养基上，置于25℃霉菌培养箱中培养，培养数天后进行纯化，纯化后得纯菌落，4℃保藏。

蓖麻籽富集法：挑选蓖麻籽10粒，煮10min，然后5粒脱皮，5粒划破，接着再煮5min。将处理好的饵料分别放入培养皿中，每皿放1粒蓖麻籽，倒入岔河水样及养鱼水体水样30mL浸没饵料，置于25℃温箱中培养，每例水样5个重复。培养2天后，把培养皿洗净，用清水换取水样，以减少其他杂菌的污染。逐日观察，发现蓖麻籽上有菌丝长出时，将长有菌落的蓖麻籽放入75%的酒精中3～5s，迅速取出，再用无菌水冲洗3次，放入培养皿中，加30mL含100mg/L链霉素的自来水，置于25℃培养箱中培养，逐日镜检，直至菌丝长出。菌丝长出后，镜检，在超净台将菌丝接种到PDA培养基上。接种好后，置于25℃霉菌培养箱中培养，培养数天后，进行纯化，反复纯化后得纯菌落，4C保藏。

菌株的鉴定：通过菌落形态、菌丝显微结构等初步鉴定菌株种类。

其他检测

除前2项检测外，还依据文献，做了供试地衣中松萝酸的检测、抑菌活性的测定和最小抑菌浓度的检测。

数据统计与分析

对所得数据用SPSS16.0进行ANOVA分析，用Duncan法进行多重比较。

结果与分析

供试地衣中松萝酸的检测

对供试地衣中松萝酸进行定性研究，检测结果表明：TLC结果样点显色比较清晰，与松萝酸对照，发现长松萝含有松萝酸，而皮果衣不含有松萝酸。用微量结晶法所得结果和薄层层析法测得结果一致。

菌株的鉴定

经河北师大微生物实验室分离、鉴定，初步确定菌株种类为：镰刀菌Fusariumsp（菌落形态及显微结构见图1）、两性绵霉Achlyabisexualis、Pythiumsp和多枝横梗霉Lichemiaramose。

松萝酸对真菌的抑制作用

按照文献提到的抑菌实验方法，制备含药培养基，测试用乙醇、丙酮、乙酸乙酯作溶剂的松萝酸溶液对供试菌株的抑制作用。由实验结果可知：接种48h后以乙醇、丙酮、乙酸乙酯为溶剂的松萝酸溶液对4种供试真菌均有一定的抑制作用。从抑制初期观察，松萝酸的乙醇溶液对供试菌株的抑制效果低于松萝酸丙酮、乙酸乙酯溶液。图2给出了不同溶剂的松萝酸溶液对镰刀菌生长的抑菌率。

两种地衣粗提液对真菌的抑制作用

实验结果表明：接种48h的平均数据测量结果，2种地衣的丙酮浸提液对供试菌株的生长初步显示出抑制作用，低浓度菌落的直径大于高浓度菌落的直径。对于同一菌株不同的地衣丙酮浸提液对其抑制活性不相同。

结论

以乙醇、丙酮、乙酸乙酯为溶剂的3种松萝酸溶液的抑菌结果表明：不同溶剂的松萝酸溶液对供试菌株均有不同的抑菌作用，丙酮、乙酸乙酯作溶剂的抑菌效果强于乙醇溶剂。

通过2种地衣的丙酮粗提液对7种供试菌株的生长进行抑制，结果显示：2种地衣丙酮粗提液对供试菌株的抑制作用不同，长松萝丙酮粗提液对供试菌株的抑菌效果好，皮果衣粗提液的抑菌效果差，说明长松萝是因为其中含有松萝酸导致抑菌作用良好。

对供试地衣中的松萝酸进行定性研究，采用微量结晶法和薄层层析法，这两种方法结果显示一致，即长松萝含有松萝酸，而皮果衣中不含松萝酸。

创新点

本实验研究了松萝酸及2种地衣粗提液对鱼病真菌的抑制作用，证明了是地衣中的松萝酸对鱼病真菌有较强抑制作用。地衣和地衣粗提物可以作为真菌抑制剂，提供了解决化学农药残留、开展真菌的生物防治的新材料。

地衣长松萝粗提物对来自渔业生产的几种常见真菌生长具有抑制的作用，且抑制作用一般随着浓度增加而增加，对农业、渔业的进一步研究推广提供了参考数据。同时，本实验还发现皮果衣粗提物对部分供试菌株的生长有一定的促进作用，具体原因有待进一步的研究。

松萝酸乙醇溶液对镰刀菌和多枝横梗霉有抑制作用，而松萝酸乙醇溶液对两性绵霉、腐霉在200mg/L、400 mg/L浓度时有促进作用；松萝酸乙酸乙酯溶液对多枝横梗霉抑制效果最好。

该项目获得第30届全国青少年科技创新大赛创新成果竞赛项目中学组植物学一等奖。

专家评语

该项目用不同方法从地衣长松萝和皮果衣中提取有效成分，发现长松萝的提取物对导致鱼病的真菌生长有抑制作用，为鱼病的天然产物防治提供了参考。学生在研究中得到了训练，研究报告书写规范，显示出较强的创新能力，建议进一步开展鱼病防治研究。