铁皮石斛中有机磷的检测方法分析

□ 厉 芬 王凤丽 朱佳茜 王新财 顾宽宇 湖州市食品药品检验研究院



铁皮石斛中有机磷的检测方法分析

□ 厉 芬 王凤丽 朱佳茜 王新财 顾宽宇 湖州市食品药品检验研究院

摘 要：本文研究的目的是制定一套成熟的铁皮石斛药材中有机磷农药多残留检测方法，以期为中药材中农药多残留检测方法的制定和完善提供依据。在空白铁皮石斛中加入41种有机磷标品，用水浸润样品，以丙酮和乙腈作为提取溶剂，高速均浆为提取手段，GPC和Carb-NH2柱固相萃取联用作为净化方式，用FPD-GC检测，发现各个农药的回收率在84.2%～105.8%，重复性在2.76%～6.58%，方法定量限在0.002～0.01 mg/kg，符合农药残留检测要求。

关键词：铁皮石斛；有机磷；凝胶净化

铁皮石斛为兰科植物石斛属铁皮石斛新鲜或干燥的茎，其含有多糖、芪类、生物碱、氨基酸和微量元素等多种成分，具有增强免疫、抗氧化、抗肿瘤、抗疲劳、降血糖和养阴生津等多种保健功能。铁皮石斛的鲜茎可直接食用，也可炖汤、泡茶、浸酒，通常加工成干品，如铁皮枫斗等。近年来，以铁皮石斛为原料的保健品越来越多，畅销国内和国外市场。但由于野生铁皮石斛资源较少，目前市场上多为栽培品，难免使用农药防治病虫害，如农药使用不当，农药残留超标将危及食品安全。

农药多残留是指使用农药之后一个时期内没有被分降解而残留于生物体内、土壤、水体、大气中的农药原体、降解物和有毒代谢物及杂质的总称。人们食用了被污染的中草药及其保健制品后，残留在其中的农药便会积聚在体内，因其代谢缓慢，最终将导致急性或慢性中毒，产生严重的后果。因此，世界各国对此高度重视，欧美国家都对传统药和草药制定了非常严格的农药多残留限量标准。农药多残留检测属于复杂混合物中痕量组分分析技术，中药材保健品农药多残留检测具有以下特点：既需要精细的微量操作手段，又需要高灵敏度的痕量检测技术［1］。农药多残留量检测方法的研究已成为影响中药国际贸易的最重要技术要求之一，影响中药保健品走向国际化与现代化。因此，研制简单、快速、准确，并可同时定性、定量的农药多残留检测方法是保障人民食品药品安全，推动中药材保健食品的现代化建设迫切需要解决的问题之一。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

所用水为经过二次蒸馏的重蒸水；丙酮、乙腈、二氯甲烷（色谱纯，默克公司）；41种有机磷标准品（国家标准物质研究中心）；无水硫酸钠（分析纯，麦克林）。

本实验采用的铁皮石斛，采购自湖州仁皇山街道康龙保健食品商行。

1.2 设备仪器

GC-FPD（Agilent7890B）、自动固相萃取仪（LAB TECH）、高速匀浆机（德国 IKA）、氮吹仪（美国Organomation）、旋转蒸发仪（德国IKA）、恒温水浴振荡器（上海精风仪器有限公司）、旋涡混匀器（IKAM S1）、高速冷冻离心机（贝克曼）。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

提取：称取2 g饮片样品粉状于均质杯中（新鲜的铁皮石斛先干燥至水分含量低于12.0%），加入6 mL水和5 m L丙酮，充分膨胀，振荡涡旋，然后加入20 mL乙腈，12 000 r/min均质1分钟；再用20 mL乙腈，均质1分钟，滤纸过滤于装有10 m L饱和氯化钠溶液中，收集滤液，盖上盖，剧烈震荡2 min，室温静置20 min，分层；取滤液过无水硫酸钠，旋转蒸发至2～3 m L，氮气吹至近干，用丙酮定容至2 mL［2］。

净化：Carb-NH2柱进一步净化。在Carb-NH2 柱中加入 1 cm无水硫酸钠，预先用 5 mL丙酮+二氯甲烷（1∶1）活化小柱，把待净化液加到已活化好的 Carb-NH2柱上，使其逐滴流下，用5 mL×2次丙酮+二氯甲烷（1∶1）洗脱。41℃以下水浴氮吹浓缩至近干，用2 mL丙酮溶解定容，供GC-FPD分析。

1.3.2 GC色谱条件

色谱柱：安捷伦DB-17（30 m ×0.32 mm× 0.25 μm）；进样口温度：220℃；检测器温度：250℃；柱温程序升温：150℃保持2分钟，以8℃/ min升至250℃，保持12分钟；柱流速：1 mL/min；不分流进样；载气：氮气，纯度≥99.999%［2］。

2 结果与分析

2.1 提取过程加水的考察

本试验考察样品在提取前加不加适量的水来考察提取效果，发现水浸润后提取液澄清透明，因为加入适量的水能增加粉状样品之间的吸附力，经过离心后能完全达到固液分离。不加水，提取后提取液浑浊，并且有粉末和纤维漂浮在上面，从而影响下面的试验。并且加了水能使提取溶剂更好地浸入样品中，从而有利于农药残留的提取［3］。

通过试验发现不加水各个农药回收率为53.1%～82.5%，而加水回收率提升到了86.2%～103.7%。因此，在有机溶剂提取样品前应先加入适量的水浸润。

2.2 提取溶剂的选择

本试验考察了正己烷、丙酮及乙腈这3种溶剂，发现丙酮和乙腈的提取效果最佳，正己烷不适合，正己烷虽然对于色素溶解性差，但是单独不能充分渗透到样品内部［3］，且不能与水相溶，使提取效率较低，41种有机磷回收率在32.9%～67.2%。丙酮这种极性物质虽然渗透性强，但是在提取过程中也同时提取出大量的杂质，使样品的目标峰被某些杂质所干扰。

乙腈渗透性强，并且对于杂质的提取效果没有丙酮有效。鉴于最后检测的检测器为FPD检测器，特征光经过磷滤光片，再由光电倍增管进行光电转换后只产生相应的电信号，因此可排除大量溶剂峰及烃类的干扰，经过后续的净化可以满足检测的要求。各个有机磷的回收率为84.6%～103.8%。

表1 不同提取方法的比较

图1 第一有机磷标准品色谱图

图2 第二有机磷标准品色谱图

图3 第三有机磷标准品色谱图

图4 第四有机磷标准品色谱图

2.3 提取方式的选择

中药材基质复杂，提取难渗透，选用适宜的提取方法，能让提取溶剂与铁皮石斛基质充分接触、渗透。本试验选用振荡提取、超声波提取和高速均浆提取3种方法考察，发现振荡提取效果较差，超声波提取其次，高速匀浆法提取效果最好。

样品中加入的提取溶剂的量对于振荡提取影响比较大，通过试验发现提取溶剂加入量越大，提取的回收率越高，但是随着提取溶剂增加，回收率提升的幅度越来越小。加入少量的溶剂，在振荡提取中不能充分与样品内部接触，从而导致提取不充分，但是大量的溶剂增加会相应的增加成本，并且振荡提取的时间也相对比较长［4］。

超声波提取也是农药残留中常见的提取方法，但是在提取过程中，超声波内部水温会随着提取时间增长而升高，而部分农药残留具有热不稳定性及挥发性，因此造成了部分农药残留回收率低下。在整个超声容器中超声波场的分布是不均匀的，类似在波场的分布中有死角，这会使部分样品的提取效率显著下降，从而导致重现性较差。

使用高速均浆法能在较短时间，用较少溶剂得到较好的回收率，并且重现性也较好。高速均浆是样品在高速搅拌下从搅拌缝隙高速喷出，高压高速情况下使铁皮石斛的粉末进一步被破坏细化，从而使提取溶剂与铁皮石斛粉末充分接触，提高了提取效率，并且提取时间也进一步缩短。

本试验也考察了超声波与振荡联用、超声波与均浆联用、振荡与均质联用，发现超声波与振荡联用回收率有了提高，但是还是没有达到试验要求。后面两者回收率与单独使用均浆法相差不多，因此选用高速匀浆法作为本试验的提取方法。

2.4 SPE净化柱的选择

样品经过提取，含有大量的色素、糖类物质，因此选用合适的固相萃取柱对样品的检测非常重要。本试验选用Carb- NH2柱、弗罗里硅土柱、C18柱和氨基柱，发现通过Carb-NH2柱能有效除去色素及糖类物质，而弗罗里硅土柱、C18柱和氨基柱这3款柱子经过样品净化，净化液还是呈现绿色，通过气相色谱检测，还是有很多杂质干扰。

因此选用Carb-NH2柱，经过FPD检测器检测，基本净化完全，满足药材中有机磷的检测要求，各个有机磷的回收率在84.7%～102.7%。

2.5 前处理方法学考证

样品中加入分成四组的41种有机磷标准品，进行加标回收、检出限及重复性试验［5］。

精密称取铁皮石斛样品40份，各个农药加标浓度为0.05 mg/kg和0.5 mg/kg两个添加水平，重复实验5次，通过GC- FPD检测，发现各个农药的回收率在84.2%～105.8%，重复性在2.76%～6.58%，符合农药残留检测要求。

图5 空白样品色谱图

图6 空白样品第一组有机磷加标浓度0.05 mg/kg色谱图

图7 空白样品第二组有机磷加标浓度0.05 mg/kg色谱图

图8 空白样品第三组有机磷加标浓度0.05 mg/kg色谱图

图9 空白样品第四组有机磷加标浓度0.05 mg/kg色谱图

3 结论

本文建立了41种有机磷在饮片铁皮石斛中的GC- FPD的前处理方法：根据实验室的实际条件，用水浸润样品，以丙酮和乙腈作为提取溶剂，高速均浆为提取手段，Carb-NH2柱固相萃取作为净化方式。该方法既可有效提取铁皮石斛中农药残留，又可完全去除杂质干扰，简便、省时、结果准确。所建立的分析方法各个农药的回收率在84.2%～105.8%，重复性在2.76%～6.58%，方法定量限在0.002～0.01 mg/kg符合农药残留检测要求。

参考文献：

［1］田金改，杜庆鹏，高天兵.HPLC测定中药中农药灭幼脲残留量的方法研究［J］.中草药，2000，31（3）：179-181.

［2］中华人民共和国农业部.蔬菜和水果中有机磷、有机氯、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农药多残留的测定（NY/T761-2008）［S］.2008.

［3］李庆，刘汉兰.中草药农药残留分析的研究进展［J］.华中农业大学学报.2002，21（2）：195-200

［4］董顺玲，胡家炽，何志强，等.中药材中氨基甲酸酯类农药残留量的反相高效液相色谱法［J］.药物分析杂志，2002，22（3）：178-182

［5］巢志茂.瓜萎中有机氯农药残留量的含量测定［J］.中国药学杂志，2004，39（3）：179-181.