生物医学样品中路易氏剂代谢产物分析检测方法研究进展

吴姬娜，刘石磊，杨旸，周世坤，刘景全

（国民核生化灾害防护国家重点实验室防化研究院，北京 102205）



生物医学样品中路易氏剂代谢产物分析检测方法研究进展

吴姬娜，刘石磊，杨旸，周世坤，刘景全

（国民核生化灾害防护国家重点实验室防化研究院，北京 102205）

摘要综述生物医学样品中路易氏剂代谢产物分析方法的研究现状，主要总结了路易氏剂染毒生物医学样品中标志物、样品制备和仪器分析方法的研究进展。路易氏剂染毒生物标志物主要包括游离和加合代谢产物两种，分析过程主要是对选定的生物标志物进行巯基化衍生和富集纯化，之后采用气相色谱-质谱、液相色谱-质谱等仪器对目标物进行检测鉴定。

关键词路易氏剂；生物医学样品；生物标志物；富集纯化；分析

路易氏剂是已知现代化学武器中唯一的含砷糜烂性毒剂［1］。武器级路易氏剂主要由路易氏剂1 （L1）、路易氏剂2 （L2）、路易氏剂3 （L3）3种成分组成，其中L1含量占90%以上［2］。在1997年生效的《禁止化学武器公约》中，将L1，L2，L3一并列入有毒化学品清单中，成为国际禁止化学武器组织核查的重要监控对象［3］。

路易氏剂染毒后会立刻造成疼痛，同时具有严重的全身性毒性［4］。路易氏剂的毒性作用机理主要在于对酶活性的抑制。人体内有20多种酶的活性依赖于巯基基团，而路易氏剂会与巯基直接结合并导致其失去活性，进而影响酶的活性，对人的生理机能造成影响［2，5］。路易氏剂染毒后，在生物医学样品中主要形成游离和加合代谢产物。其中游离代谢产物氯乙烯基亚胂酸（CVAA）、氯乙烯基胂酸（CVAOA）分别由L1经水解和继续氧化形成，加合代谢产物是路易氏剂的含砷基团（-AsCl2）与巯基（-SH）发生强相互作用形成。

路易氏剂自研制成功之日起，便作为化学战剂被发展并生产。各国仍未彻底销毁的武器储存以及日本遗留在我国的化学弹药对于进行化学战剂储存、运输、销毁等涉毒工作人员及人民群众来说是不可忽视的潜在威胁［6-7］。不仅如此，路易氏剂还有可能成为恐怖分子进行恐怖袭击的新手段［8］，对公共安全构成威胁。因此各国对于路易氏剂的相关研究一直在持续进行，研究内容涉及毒理探索、毒剂销毁、临床解毒、染毒洗消和涉毒防护等方面，而分析方法作为一种重要技术支撑也备受重视。笔者对染毒生物医学样品中路易氏剂代谢产物的分析方法进行综述，重点总结染毒标志物、样品制备和仪器分析方法的研究进展。

1 路易氏剂染毒的生物标志物

对生物医学样品中化学战剂的代谢产物进行分析，可为毒剂暴露染毒提供定性和定量的证据。作为毒剂暴露染毒的明确标志物，需要满足特异性强、半衰期长、化学性质稳定、非化武来源等要求，旨在实现染毒后中长期准确溯源性分析检测［9-10］。

路易氏剂初期的分析检测主要以砷元素为标志物，使用电感耦合等离子体光谱（ICP）、原子吸收光谱（AAS）等选择性检测器检测As的存在，进而证明路易氏剂的暴露染毒［11］。但是由于未染毒的样品中可能具有一定强度的As信号，同时生物医学样品中含有的氯与氩气会形成ArCl+（m/z 75）从而干扰As+（m/z 75）的检测［12］，因此需要找寻能够更加清晰准确地验证路易氏剂染毒事实的生物标志物。L1在含水基质中会快速水解形成CVAA，而CVAA在合适的条件下会继续氧化形成CVAOA，三者均可与巯基发生相互作用。因此人们推测，路易氏剂染毒的生物标志物主要包括游离的L1，CVAA，CVAOA以及与蛋白质等大分子形成的加合代谢产物。

游离的L1含量很低，遇水反应，故并不适合作为路易氏剂染毒的生物标志物。而CVAA与CVAOA作为L1的水解、氧化产物，较L1而言性质更加稳定，含量更高，可以成为理想的生物标志物。目前文献报道已从染毒尿样中成功检测出CVAA和CVAOA。关于CVAA，CVAOA的相对含量，不同研究之间存在一些争议。由于CVAA，CVAOA均是非挥发性物质，不适宜直接进行气相色谱（GC）分析，且经过具有还原性的巯基化试剂衍生后生成相同的衍生产物，故使用GC通常难以对二者进行区分。大多使用GC对路易氏剂染毒样品进行分析的实验，都选择CVAA作为标志物［10，13-17］，但不能排除CVAOA经过衍生后被同时分析的可能。对于使用液相色谱（LC）的实验［12，18］，报道中主要检测到的代谢产物是CVAOA而非CVAA，但无法证明该结果是代谢造成还是在样品采集处理过程中氧化造成的。虽然游离代谢产物具有良好的特异性，但半衰期较短，故对加合代谢产物的分析不可忽视。

路易氏剂加合代谢产物主要是由分子中的含砷基团与体内含有巯基的半胱氨酸（Cys）、谷胱肽（GSH）以及含有半胱氨酸的蛋白质（Pr）等结合而成。2000年，Fidder等［17］通过同位素标记法证明了生物医学样品中路易氏剂与球蛋白加合代谢产物的存在，发现路易氏剂与球蛋白β-链上的Cys-93，Cys-112发生共价结合。同时，由于同位素标记染毒的全血样品放射性大多出现在红细胞中，猜测应是路易氏剂与红细胞中的谷胱甘肽发生了结合。但是，Fidder A的实验中并未发现路易氏剂与白蛋白的加合代谢产物，未对路易氏剂与谷胱甘肽的加合代谢产物进行检测，这些方面有待进一步研究。2014年，Naseri等［10］在实验中证明了CVAA可与半胱氨酸反应形成加合物CVAA-Cys，并且验证了CVAA与Cys加合物结构只有1∶1一种。但实验中只对CVAA-Cys标样进行了色谱分析，并未对生物医学样品中的加合物进行检测。另外，巯基化试剂可以与路易氏剂的游离代谢产物和加合代谢产物反应生成易于分析检测的同种衍生产物，因此专门检测大分子加合代谢产物的文献报道较少。

2 路易氏剂及其代谢产物的衍生方法

分析化学战剂代谢产物的过程中，某些目标物由于挥发性、活性、色谱特征等因素，可能不适于直接进行气相色谱（GC）分析，通常可以使用衍生方法改善目标物的色谱性能［19］。由于L1，L2会与柱涂层或其它亲核位点发生相互作用，同时路易氏剂在GC中响应不佳、灵敏度较差，故路易氏剂不适于直接进行GC分析。此外，L1的游离代谢产物CVAA，CVAOA是非挥发性物质，也不适于直接进行GC分析。因此大多文献中都选择使用衍生化试剂衍生路易氏剂代谢产物，再以GC为分离手段进行分析。路易氏剂经过巯基化试剂衍生后，不仅色谱特征得到改善，还生成含硫衍生产物，可以使用选择性检测器进行分析，提高检测的选择性和灵敏度［19］。而使用液相色谱-质谱（LC-MS）分析路易氏剂时，由于电离效率较低，可以使用巯基吡啶对CVAA进行衍生，提高其灵敏度［20］。

路易氏剂的衍生方法已经相对成熟，且可被借鉴并用于路易氏剂代谢产物的衍生过程。不同文献报道的衍生方法的主要差异在于衍生试剂的选择，普遍使用的是单巯基和二巯基烃类或醇类，见表1。

表1 常见的巯基化衍生试剂

从衍生试剂的比对选择实验中可知，单巯基衍生试剂在实验过程中可以实现L1，L2的分别检测，完全区分二者，故被广泛用于路易氏剂染毒环境样品的研究中，被使用较多的为BT。而二巯基衍生试剂可以将L1，L2，CVAA，CVAOA衍生为同一产物，从而提高路易氏剂分析灵敏度，受到众多学者的青睐，其中使用最广泛的是EDT和PDT。对于具有“路易氏剂特效药”之称的BAL，虽然分析灵敏度不及其它衍生试剂，但由于其在临床诊断和解毒效果评价方面具有特殊的研究价值，也被进行了广泛的使用和研究。Fidder等［17］还尝试使用七氟丁基咪唑（HFBI）处理BAL衍生产物，以提高检测灵敏度，检测限可达到10 nmol/L （1.5 ng/mL）。但是，HFBI衍生后的产物需要使用气相色谱-负化学电离/质谱（GC-NCI/MS）进行分析，虽然灵敏度有所提高，但非特异性离子占据优势，缺少准分子离子，同时样品中残留的氟化物对仪器具有较大的损害，故未被广泛采用。

3 路易氏剂代谢产物的富集纯化

除衍生外，目标物的富集纯化也是样品制备的重要环节，其目的是尽可能富集纯化基质中的目标物，得到浓度高、背景干扰小的样品。在路易氏剂代谢产物的分析检测研究中，涉及的生物医学样品基质主要包括尿样和血样。其中尿样的分析和获取比较简单，故大部分研究者选择尿样进行分析。通常采用优化的巯基化衍生方法，结合有效的富集和纯化手段，对目标物进行检测，可以达到理想的检测限。对血样进行分析检测时，样品富集纯化的难度较大，这是由于血样的组成比尿样更加复杂，含有的干扰物，特别是大分子干扰物较多，最终检测限普遍比尿样高［13-15］。

传统的富集纯化方法有液-液萃取（LLE）和固相萃取（SPE）两种，后来相关领域的工作者们又研究了富集效率更高的液相微萃取（LPME）和固相微萃取（SPME）方法。在对路易氏剂代谢产物进行分析检测的过程中，4种富集纯化方法各有特点，被不同的学者选择使用［10，13-14，16，18，21，23，25］。

4 路易氏剂代谢产物的检测鉴定方法

对路易氏剂的检测鉴定始于20世纪50年代，起初主要采用化学分析法，包括传统的电势滴定法、汞溴红试纸法（羟汞基荧光黄钠盐试纸法）、侦检管法、钼蓝比色法、紫外吸收分光光度法等。随着样品制备技术和检测鉴定方法的改进，检测限从mg/mL级降至μg/mL级［37-38］。20世纪90年代后，随着仪器技术的不断发展，逐渐出现的一些准确度和精密度高、操作简便的现代化仪器分析方法［38］，成为检测路易氏剂代谢产物的主要方法，主要包括以气相色谱为分离手段的检测鉴定方法及以液相色谱为分离手段的检测鉴定方法。

4.1 气相色谱法

气相色谱作为实验室常用的分离技术与痕量分析方法具有分离效率高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、样品用量少等优点，在检测鉴定路易氏剂代谢产物方面得到了广泛的应用。根据检测方式的不同，以气相色谱为分离手段的分析方法主要包括气相色谱-质谱检测法（GC-MS）［10，13，20-23，26，30，31］、气相色谱-火焰光度检测法（GC-FPD）［24，27-28］、气相色谱-脉冲火焰光度检测法（GC-PFPD）［29］、气相色谱-原子发射光谱检测法（GC-AED）［14，32］等。其中GC-MS是使用最广泛的检测鉴定方法，大多文献报道中都选择使用选择离子模式（SIM）以提高分析灵敏度［13，16，22，30-31］。在采用气相色谱电子轰击电离/质谱-选择离子模式（GC-EI/MS-SIM）进行检测时，进行定量所选择的离子主要包括衍生产物的分子离子［M+.］或脱去氯乙烯基得到的离子例如，Wooten J V［16］在实验中选择的是［M+.］ （m/z=242）作为CVAA-PDT的定量离子，M.T Naseri［10］也选择了［M+.］（m/z=228）对CVAA-EDT进行定量，而宋婷婷［15］则在实验中选择了）作为CVAA-DMT的定量离子。

对于尿样或血样中路易氏剂代谢产物的检测，巯基化衍生-富集纯化-气质分析方案被广泛采用。自2000年起，先后有4篇文献报道了对人尿样体外染毒的分析实验，均取得了良好的结果。Fidder等［17］采用的是传统的BAL衍生、SPE萃取、GC-MS检测的分析方法，检测灵敏度可以达到1.5 ng/mL。随后的研究中，使用更有效的衍生试剂（EDT，PDT，DMT等）和/或新型萃取方法（SPME，LPME等），最低检测限达到了7.4 pg/mL［16］。由于活体染毒实验比仿生实验的分析更加复杂，难度更高，使用相同方法对鼠（Rat）体内染毒后采集的尿样进行分析检测，检测限只能达到0.1 ng/mL［13］。由于血样的组成比尿样更加复杂，含有的干扰物特别是大分子干扰物较多，分析难度大，检测限较尿样要高。研究者分别对全血、血浆和红细胞样品进行研究，得到的检测限分别为30 pg/mL［14-15］，1 ng/mL［13］，10 ng/mL［13］。宋婷婷等［14-15］使用相同的方法处理体外染毒的尿样和血样，CVAA在血样中的检测限（30 ng/mL）是尿样的2倍。Koryagina 等［13］同样对染毒尿样、血浆、红细胞进行了分析，得到的灵敏度依次降低一个数量级（LOD尿样=0.1 ng/mL，LOD血浆=1 ng/mL，LOD红细胞=10 ng/mL）。

4.2 液相色谱法

由于路易氏剂的特殊化学性质，不衍生很难对其直接进行GC分析，但液相色谱却可以克服气相色谱方法的不足，直接对路易氏剂进行测定。Kinoshita等尝试不采用衍生方法，对生物医学样品中的路易氏剂代谢产物直接进行分析检测，检测限均可达到ng/mL级。Kinoshita等［12］采用高效液相色谱-电感耦合等离子体光谱/质谱法（HPLCICP/MS），在实验中同时分离并检测包含CVAA，CVAOA在内的4种含砷化合物，以［AsO+］（m/z= 91）作为定量离子，得到CVAA的检测限（以砷计）为0.2 ng/mL，CVAOA检测限为0.1 ng/mL。Rodin等［18］使用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）分析染毒样品，通过多反应监测模式（MRM）提高检测灵敏度，得到CVAA，CVAOA的检测限分别为0.5，3 ng/mL，对应的定量离子对分别为m/z 213，169 和m/z 185，123。

通过对文献报道进行比对分析可以看出，目前对生物医学样品中路易氏剂代谢产物进行的分析检测涉及样品基质、衍生试剂和萃取方法等方面，检测灵敏度较理想，文献报道中的检测限（LOD）通常可达ng/mL级，其中文献［10，15-16］中检测限达到了pg/mL级。Wooten等［16］在实验中分析检测染毒尿样中的CVAA，得到LOD=7.4 pg/mL（已报道文献中检测限最低的是采用自动化SPME-GC/MS分析方法，需要特殊的仪器装置）。宋婷婷等［15］在实验中对衍生试剂进行优化，选择衍生效率较高的DMT，提高了检测灵敏度，LOD达到pg/mL级。2014年，Naseri等［10］将新型分散衍生液液微萃取方法（DDLLME）用于研究之中，有效提高了衍生和萃取效率，得到检测限为15 pg/mL。因此新型分析仪器、高效衍生化试剂、新型萃取手段等都是提高分析检测灵敏度的有效方法。表2归纳了文献报道的生物样品中路易氏剂代谢产物的分析方法。

表2 生物医学样品中路易氏剂代谢产物的分析现状

5 结语

虽然路易氏剂已被OPCW列入《禁止化学武器公约》附表，但却没有如其它化学战剂一样被系统地进行研究，目前建立完善的染毒生物医学样品检测方法已成为各国的研究重点，而路易氏剂也必将成为研究热点。随着新型分析检测仪器、样品制备方法的不断创新和发展，路易氏剂代谢产物的分析方法将会向着简便、快速、灵敏、准确、可靠等方向发展。

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联系人：刘石磊；E-mail： liushilei402@263.com

中图分类号：O656

文献标识码：A

文章编号：1008-6145（2016）01-0099-05

doi：10.3969/j.issn.1008-6145.2016.01.029

收稿日期：2015-11-08

Research Progress in Analysis Methods of Lewisite Metabolites in Biomedical Samples

Wu Jina， Liu Shilei， Yang Yang， Zhou Shikun， Liu Jingquan
（State key Laboratory of NBC Protection for Civilian， Research Institute of Chemical Defence， Beijing 102205， China）

AbstractThe development on the analysis methods of Lewisite metabolites in biomedical samples was reviewed. Biomarkers in biomedical samples after lewisite exposure，and methods for sample preparation and instrumental analysis methods were summaried mainly. There are mainly two types of biomarkers including free metabolites and adducted metabolites. Generally，the analytical procedure involves derivatization of the biomarkers in biomedical samples，enrichment and purification of the derivatives. The target compounds were detected by gas chromatography-mass spectrometry or liquid chromatography-mass spectrometry.

Keywordslewisite； biomedical sample； biomarker； enrichment and purification； analysis