不同生长期灵芝子实体三萜酸和多糖含量测定

李保明　华正根　王洪庆　刘 超　李 晔　陈若芸*（. 天然药物活性物质与功能国家重点实验室 中国医学科学院 北京协和医学院药物研究所，北京 00050；. 福建仙芝楼生物科技有限公司 国家食用菌加工技术研发分中心 福建省药用菌工程研究中心，福州 35000）



不同生长期灵芝子实体三萜酸和多糖含量测定

李保明1华正根2王洪庆1刘 超1李 晔2陈若芸1*
（1. 天然药物活性物质与功能国家重点实验室 中国医学科学院 北京协和医学院药物研究所，北京 100050；2. 福建仙芝楼生物科技有限公司 国家食用菌加工技术研发分中心 福建省药用菌工程研究中心，福州 350002）

摘 要分别采用HPLC法和药典法测定不同生长期灵芝子实体中三萜酸和灵芝多糖的含量。HPLC法色谱条件：色谱柱为Alltech Alltima C18柱（150 mm×4.6 mm，5 µm），流动相为乙腈-0.04%甲酸溶液，检测波长254 nm，流速1.0 mL/min，柱温15 ℃。结果：灵芝酸C2、灵芝酸G、灵芝烯酸B、灵芝酸B、灵芝烯酸A、灵芝酸A、灵芝酸D、灵芝烯酸D和灵芝酸C1的线性范围为5.9～42.0 µg/mL，r为0.999，加样回收率为96.42%～104.14%。表现方法可行、重现性好，能定量测定灵芝中三萜酸和多糖的含量。

关键词灵芝；生长期；三萜酸；多糖；含量测定

灵芝（Ganoderma lucidum）为灵芝科灵芝属药用真菌，在我国有广泛、大量的栽培。研究人员从灵芝属真菌中分离到了近400种化合物，但其活性成分主要为三萜和多糖类化合物［1］，为了更深入地了解灵芝不同生长期三萜和多糖的含量，我们对生长在福建省武夷山基地的不同生长阶段灵芝子实体的化学成分进行了测定，为灵芝的合理开发利用提供科学依据。

1　三萜酸测定

1.1供试材料

9种灵芝三萜酸对照品均由本实验室提供，经IR、UV、NMR、MS等光谱鉴定，HPLC分析纯度为98%以上；赤芝（Ganoderma lucidum）药材来源于福建仙芝楼生物科技有限公司武夷山栽培基地。

1.2测定方法与结果［2］

（1）色谱条件。色谱柱：Alltech Alltima C18（150 mm×4.6 mm，5 µm）。流动相为0.04%甲酸-乙腈。梯度洗脱条件：0～10 min，乙腈20%→25%；10～20 min，乙腈25%→30%；20～50 min，乙腈 30%→30%；50～65 min，乙腈30%→38%；65～80 min，乙腈为38%。柱温15℃；流速1.0 mL/min ；进样量20 µL；检测波长254 nm。

（2）对照品溶液的制备。精密称取灵芝酸C2、灵芝酸G、灵芝烯酸B、灵芝酸B、灵芝烯酸A、灵芝酸A、灵芝酸D、灵芝烯酸D、灵芝酸C1对照品适量，加甲醇溶解并制成约50 mg/L的对照品溶液。

（3）样品溶液的制备。取灵芝子实体粉末（过2号筛）0.5 g，精密称定，加入甲醇100 mL，加热回流1小时，冷却后过滤，浓缩至干，残渣加甲醇溶解，转移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，过滤，取滤液，作为供试品溶液。

（4）方法学考察。①线性关系考察：精密吸取浓度为50 mg/L的对照品溶液0.25、0.50、0.75、1.0、1.5 mL置于2 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取20 µL，注入色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积；以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标进行线性回归，得灵芝酸C2回归方程为Y=0.921 X-0.285，r=0.9992；灵芝酸G 为Y=1.28 X-2.15，r=0.9992；灵芝烯酸B 为Y=1.90 X-12.8，r=0.9994；灵芝酸B为Y =1.24 X+1.29，r=0.9992；灵芝烯酸A为Y= 2.60X-4.30，r=0.9992；灵芝酸A为Y=1.27 X +16.3，r=0.9995；灵芝酸D为Y=1.33 X+4.51，r=0.9990；灵芝烯酸D为Y=2.70 X-17.1，r= 0.999 2；灵芝酸C1为Y=1.16 X+8.41，r=0.9994。表明灵芝酸C2、灵芝酸G、灵芝烯酸B、灵芝酸B、灵芝烯酸A、灵芝酸A、灵芝酸D、灵芝烯酸D、灵芝酸C1分别为0.136～0.818 µg、0.128～0.765 µg、0.135～0.810 µg、0.128～0.765 µg、0.119～0.713 µg、0.118～0.705 µg、0.140～0.840 µg、0.124～0.743 µg、0.121～0.728 µg，与峰面积呈良好的线性关系。

②精密度试验：取样品溶液，按上述色谱条件连续进样6次，每次进样20 µL，计算灵芝酸C2、灵芝酸G、灵芝烯酸B、灵芝酸B、灵芝烯酸A、灵芝酸A、灵芝酸D、灵芝烯酸D、灵芝酸C1峰面积的RSD分别为0.53%、0.89%、0.45%、0.48%、0.67%、1.2%、0.53%、0.53%和 1.1%。说明仪器精密度良好。

③稳定性试验：取样品溶液，按上述色谱条件分别在0、4、8、12、24 h进样，进样量为20 µL，计算灵芝酸C2、灵芝酸G、灵芝烯酸B、灵芝酸B、灵芝烯酸A、灵芝酸A、灵芝酸D、灵芝烯酸 D、灵芝酸 C1峰面积的 RSD分别为0.63%、0.85%、0.62%、0.76%、0.86%、1.3%、0.56%、0.73%和1. 2%。说明样品在24 h内稳定。

④重现性试验：取段木灵芝粉末6份，按“1.2 （3）”项的方法平行制取样品溶液并测定，灵芝酸C2、灵芝酸G、灵芝烯酸B、灵芝酸B、灵芝烯酸A、灵芝酸A、灵芝酸D、灵芝烯酸D、灵芝酸C1的峰面积的RSD分别为2.2%、0.41%、3.4%、2.1%、3.1%、0.53%、3.3%、0.39%和1.7%，重复性良好。

⑤回收率试验：取已知含量的灵芝粉末5份，分别精密适量加入9种对照品混合溶液，按照样品测定项下方法测定，计算回收率。结果其平均回收率分别为 102.14%、102.29%、100.64%、103.27%、104.14%、103.19%、96.42%、102.46%、101.50%，RSD为1.5%、0.96%、1.8%、1.3%、1.7%、2.5%、0.62%、2.9%和1.3%。

（5）样品溶液三萜酸含量的测定。在已选定的色谱条件下进样20 µL按外标法定量，分别计算样品中三萜酸的含量，结果见表1。

表1　不同生长期灵芝样品中的三萜酸含量

2　多糖的测定

2.1测定方法［3］

（1）对照品溶液的制备。取葡萄糖对照品适量，精密称定，加水制成每1 mL含0.1 mg的对照溶液。

（2）标准曲线的制备。分别精密量取对照品溶液 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，置于10 mL具塞试管中，加水至2.0 mL，精密加入硫酸蒽酮溶液（精密称取蒽酮0.1 g，加80%的硫酸溶液100 mL使溶解，摇匀）6 mL，摇匀，置水浴中加热15 min，取出，放入冰浴中冷却15 min，以相应的试剂为空白，采用紫外-可见分光光度法，在625 nm处测定波长为横坐标，绘制标准曲线。

（3）样品溶液的制备。取灵芝子实体粉末2 g，精密称定，置于索氏提取器中，加水90 mL，加热回流提取至提取液无色，提取液转移至 100 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，精密量取10 mL，加入乙醇150 mL，摇匀，4 ℃放置12 h，取出，离心，倾去上清液，沉淀加水溶解，转移至50 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀。

（4）样品测定。精密量取样品溶液2 mL，置10 mL具塞试管中，照标准曲线的制备方法测定，按标准曲线计算样品溶液中含葡萄糖的量。

2.2不同生长期灵芝样品的多糖含量测定结果

生长期1的多糖含量为0.874%；生长期2的多糖含量为0.424%；生长期3的多糖含量为0.426%；生长期4的多糖含量为0.284%；生长期5的多糖含量为0.149%；生长期6的多糖含量为0.387%。

3　讨 论

从测定的结果看，同一品种的灵芝子实体在不同的生长期三萜酸的含量有较大差异，其中，第7天含量最高，第14天和第7天基本一致，而在第210天后有明显下降，降幅达到50%；多糖含量也是第7天最高，第14天明显下降，降幅达到50%。从试验结果可以看出，三萜酸和多糖的含量随着生长期的延长有同样下降的趋势，可能的原因是灵芝子实体的木质部生长比较快，子实体重量增加比较多，而化合物积累比较慢，所以含量出现下降。实际栽培中，在灵芝子实体生成原基阶段，会将弱小、多余的原基剪切掉，只留1个强壮的原基长成子实体。这些剪切下的原基，三萜酸和多糖含量都比较高，可以作为灵芝精粉或保健品的提取原料加以利用。

参考文献

［1］ 林志彬主编. 灵芝的现代研究［M］. 第四版， 北京: 北京大学医学出版社， 2015.

［2］ 李保明， 古海锋， 李晔， 等. HPLC测定不同产地灵芝中9种三萜酸 ［J］. 中国中药杂志， 2012， 37（23）: 3599-3603.

［3］ 中华人民共和国药典2015版一部［M］. 第1版， 北京: 中国医药科技出版社， 2015: 188-189.

*为通讯作者

中图分类号：S646

文献标识码：A

文章编号：2095-0934（2016）01-051-03