滤泡辅助性T细胞在系统性红斑狼疮患者外周血中的变化

王元元陆杨唐洁查成柴继侠贺文欣胡小冬谢长好



·论著·

滤泡辅助性T细胞在系统性红斑狼疮患者外周血中的变化

王元元1陆杨2唐洁3查成3柴继侠1贺文欣1胡小冬1谢长好2

【摘要】目的 检测系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）患者外周血滤泡辅助性T细胞（T follicular helper cells，Tfh）的表达变化，探讨Tfh细胞在SLE发病中的意义。方法 应用流式细胞仪检测32例SLE患者和28例健康对照者外周血Tfh细胞的表达水平，以及CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD3+CD4+CXCR5+T细胞的表达水平。结果 SLE患者组外周血Tfh细胞百分率高于健康对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。CD3+T细胞百分率、CD3+CD4+T细胞百分率及CD3+CD4+CXCR5+T细胞百分率与健康对照组差异均无统计学意义（P ＞0.05）。结论 SLE患者外周血Tfh细胞的表达水平明显升高，可能在其发病过程中起一定作用。

【关键词】系统性红斑狼疮；滤泡辅助性T细胞；流式细胞术

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一个慢性全身性自身免疫性结缔组织病，它以多克隆B细胞高度活化增殖、免疫球蛋白增多和多种自身抗体的生成为特征，发病机制尚不明确。随着Tfh细胞亚群的发现及对B细胞分化、成熟和抗体分泌功能的不断认识［1］，Tfh细胞在SLE发生发展中的重要作用日益显现。Tfh细胞表达转录因子Bcl-6［2］，标志性表达CXCR5，可诱导T细胞共刺激因子（inducible T cell costimulator，ICOS）、程序性死亡分子1（programmed death1，PD-1）等表面分子［3］。PD-1调节生发中心B细胞的存活和选择，是浆细胞形成的必要因素［4］，因此以CD3+CD4+CXCR5+PD-1+定义Tfh细胞。笔者运用流式细胞术检测SLE患者外周血Tfh细胞水平，以探讨Tfh细胞对SLE发病机制的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料

32例SLE患者来自蚌埠医学院第一附属医院风湿免疫科2016 年3月～2016年5月住院患者，其中男1例，女31例，平均年龄（40.50±12.16）岁，临床诊断符合美国风湿病学会（ARA）1997年修订的分类标准。所有患者无风湿性关节炎、强制性脊柱炎等其他的自身免疫性疾病。健康对照组28例，均为健康志愿者，男4例，女24例，平均年龄（37.86±7.80）岁。两组性别、年龄差异无统计学意义（P=0.470，P＞0.05）。

1.2 试剂和仪器

FITC标记的抗PD-1单克隆抗体及其同型对照抗体，PE标记的抗CXCR5单克隆抗体及其同型对照抗体，PerCP标记的抗CD4单克隆抗体均为美国eBioscience公司产品；APC标记的抗CD3单克隆抗体，为美国Biolegend公司产品；流式细胞仪为FACSVerse，美国Becton Dickinson公司产品。

1.3 方法

1.3.1 直接免疫荧光标记 采集受试者清晨空腹状态下外周静脉血2 ml，EDTA抗凝，血标本在6 h内上流式机检测。取流式试管8支，试管1中未加入抗体，为调节各荧光通道的电压用；试管2、3、4、5为调荧光通道补偿用；试管6为同型对照用，加入荧光抗体CD3-APC、CD4-PerCP、MouseIgG2b-PE，试管7为同型对照用，加入荧光抗体CD3-APC、CD4-PerCP、CXCR5-PE、MouseIgG1-FITC，试管8为测试管，加入荧光抗体CD3-APC、CD4-PerCP、CXCR5-PE、PD-1-FITC。血标本50 μl分别加入到上述8支流式管中，与荧光抗体充分混匀，室温避光放置15 min；加入溶血剂1 ml/管，充分震荡混匀，室温避光放置10 min，使红细胞充分裂解；离心1 500 r/min×5 min，倒上清液；加入染色缓冲液（SB）1 ml/管，洗涤，再次离心，1 500 r/min×5 min，倒上清液；最后加入1%多聚甲醛（PFA）固定液300 μl/管，流式机检测。

1.3.2 流式细胞仪检测 运用FACSVerse流式细胞仪，设置相应各通道电压和通道之间荧光补偿后，经FSC、SSC设定淋巴细胞群为P1门，以CD3定义T细胞；CD3、CD4定义CD4+T细胞；CD3、CD4、CXCR5、PD-1定义Tfh细胞。测定CD3+T细胞占淋巴细胞百分率、CD4+T细胞占CD3+T细胞百分率、CD4+CXCR5+T细胞占CD4+T百分率和Tfh细胞占CD4+T百分率，见图1。

1.4 统计学分析

运用统计学软件SPSS 17对数据进行统计描述和分析，结果以（±s）表示，两组间的比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

图1 SLE患者外周血CD4+T细胞，CD4+CXCR5+T细胞，Tfh细胞的测定

2 结果

SLE患 者 外 周 血CD3+T细 胞、CD4+T细 胞、CD3+CD4+CXCR5+T细胞和Tfh细胞的表达：SLE患者组和健康对照组外周血CD3+T细胞占淋巴细胞的百分率，CD4+T细胞占CD3+T细胞的百分率，CD3+CD4+CXCR5+T细胞占CD4+T细胞的百分率，Tfh细胞占CD4+T细胞的百分率见下表。SLE患者组Tfh细胞表达高于健康对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）。其余差异均无统计学意义（均P＞0.05，见表1）。

表1 SLE患者组及健康对照组外周血CD3+T细胞、CD3+CD4+T细胞、CD3+CD4+CXCR5+T细胞及Tfh细胞的表达（%）

3 讨论

SLE的发病机制尚不明确，以多克隆B细胞高度增殖活化、免疫球蛋白增多和多种自身抗体的生成为特征，而近年来发现的Tfh细胞则在B细胞增殖分化、刺激免疫球蛋白分泌中发挥重要作用。其表面表达趋化因子受体CXCR5和转录因子Bcl-6以及ICOS、PD-1等表面分子，分泌IL-21、IL-17等细胞因子。

本研究中，SLE患者组外周血CD3+T细胞占淋巴细胞百分率、CD4+T细胞占CD3+T细胞百分率与健康对照组差异无统计学意义，而CD3+CD4+CXCR5+T细胞占CD4+T细胞百分率与健康对照组之间虽无明显差异，但其中表达PD-1的这群CD3+CD4+CXCR5+T细胞亚群，即Tfh细胞，它的表达却高于健康对照组，这提示Tfh细胞的高表达可能与SLE的发生有关。

B细胞分化、增殖、突变，高亲和力B细胞出现及长效记忆性B细胞出现和浆细胞分化都需要在淋巴滤泡生发中心中完成。淋巴滤泡生发中心形成、抗原特异性记忆B细胞和浆细胞的产生都必须CD4+T细胞的参与［5］。CD4+T细胞在不同的细胞因子、微环境的影响下分化为不同的CD4+T细胞亚类，这些效应细胞亚类有不同的作用，其中Th1细胞介导细胞免疫，Th2细胞介导抗细胞外寄生虫免疫，Th17细胞介导皮肤黏膜免疫和抗微生物感染免疫，而Tfh细胞则在生发中心与B细胞相互作用，辅助B细胞活化或分化，并帮助产生长效抗体反应［6-7］。若Tfh细胞升高则产生大量Ig［8］。MRL/lpr狼疮鼠缺乏生发中心，但是在滤泡外有Tfh样细胞，此类细胞可以辅助B细胞发生免疫球蛋白类别转换，诱导B细胞分泌免疫球蛋白［9］。在获得性系统性红斑狼疮小鼠模型中，Tfh细胞分化的负性调节蛋白-Roquin蛋白突变缺失，导致Tfh数量增高，最终导致系统性红斑狼疮的发生［10］。Rui YX等［11］研究发现，B细胞与CD4+T细胞作用后，PD-1在Tfh细胞表面表达上调。Tfh表达的CXCR5和配体CXCL15结合，引导Tfh细胞进入B细胞滤泡，形成生发中心［12］，生发中心B细胞在其协助下分化为记忆型B细胞和浆细胞，在记忆型B细胞和浆细胞的表面均可检测到PD-1的表达［13］。以上实验结果初步证明了SLE患者存在功能异常表达的Tfh细胞，与SLE的发生密切相关。

综上所述，Tfh细胞可能参与SLE的发病过程，但其在SLE发病中的具体作用机制尚不清楚，仍需对其进一步研究。

参考文献

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【中图分类号】R593

【文献标识码】A

【文章编号】1674-9308（2016）15-0039-03

doi：10.3969/j.issn.1674-9308.2016.15.024

基金项目：安徽省高等学校自然科学研究一般项目（KJ2015B009by） 安徽省高等学校自然科学研究重点项目（KJ2016A475） 安徽省高等学校自然科学研究一般项目（KJ2013B139）

作者单位：1 安徽省蚌埠医学院组织学与胚胎学教研室，安徽 蚌埠233030；2 安徽省蚌埠医学院第一附属医院风湿免疫科，安徽 蚌埠233004；3 安徽省蚌埠医学院科研中心，安徽 蚌埠 233030

通讯作者：谢长好，E-mail：uglboy2002@126.com

The Increace of Tfh Cells From the Peripheral Blood of Patients With Systemic Lupus Erythematosus

WANG Yuanyuan1LU Yang2TANG Jie3ZHA Cheng3CHAI Jixia1HE Wenxin1HU Xiaodong1XIE Changhao2
1 Department of Histology and Embryology， Bengbu Medical College， Bengbu Anhui 233030， China， 2 Department of Rheumatology and Immunology， The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College， Bengbu Anhui 233004， China， 3 Research Center， Bengbu Medical College， Bengbu Anhui 233030， China

［Abstract］Objective To detect expression of Tfh cells from the peripheral blood of patients with systemic lupus erythematosus （SLE） and discuss Tfh significance in SLE pathogenesis. Methods The expression of Tfh cells，CD3+T， CD4+T and CD3+CD4+CXCR5+T was examined in 32 SLE patients and 28 healthy controls （HC） by flow cytometry. Results The Proportions of Tfh cells were significantly increased in SLE patients as compared with HC （P＜0.05）. The number of CD3+T， CD3+CD4+T and CD3+CD4+CXCR5+T were pointless in SLE patients compared with HC （P＞0.05）. Conclusion The aberrations of Tfh cells were observed in patients with SLE. Tfh cells may play a role in the pathogenesisof SLE.

［Key words］Systemic lupus erythematosus， Tfh， Flow cytometry