HPLC同时测定清火胶囊中5种成分的含量

伍国怡

【摘 要】 目的：建立HPLC法测定清火胶囊中靛玉红、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素和大黄酚含量的方法。方法：采用Eclipse XDB（4.6×250 mm）色谱柱；流动相为甲醇-0.1%磷酸溶液，梯度洗脱；流速为0.80 ml/min；检测波长：289 nm。结果：靛玉红、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素和大黄酚与其相邻质峰能完全分离。靛玉红、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素和大黄酚的线性范围分别为：0.050～5.00μg/ml（r=0.9999）、0.391～39.1μg/ml（r=0.9999）、0.696～69.6μg/ml（r=0.9997）、0.216～21.6μg/ml（r=1.0000）、0.212～21.2μg/ml（r=1.0000）；方法回收率均不低于97%。结论：该方法灵敏度高、简便、准确，可用于清火胶囊的质量控制。

【关键词】 HPLC；靛玉红；芦荟大黄素；大黄酸；大黄素；大黄酚；清火胶囊

【中图分类号】R286.0 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2016）11-0019-03

Abstract：Objective HPLC method was established for the determination of Indirubin、Aloe-emodin、Rhein、Emodin and Chrysophanol in Qinghuo capsules.Methods Eclipse XDB（4.6×250mm） column was used with the mobile phase of methonal-0.1% phosphate acid solution by gradient elutio，The flow rate was 0.80ml/min. The detection wavelength was set at： 289nm.Results Indirubin、Aloe-emodin、Rhein、Emodin and Chrysophanol could be completely separated from interfacing impurity peaks. The HPLC method showed agood linear relationship in the range of 0.050～5.00μg/ml（r=0.9999）for Indirubin，0.391～39.1μg/ml（r=0.9999） for Aloe-emodin，0.696～69.6μg/ml（r=0.9997）for Rhein，0.216～21.6μg/ml（r=1.0000） for Emodin，0.212～21.2μg/ml（r=1.0000）for Chrysophanol. Recoveries for the three components were all above 97%. Condusion The method is sensitive， simple， accurate， and can be used for the quality control of Qinghuo capsules.

Keywords：HPLC；Indirubin；Aloe-emodin；Rhein；Emodin；Chrysophanol；Qinghuo Capsules

清火胶囊是由大青叶、大黄、石膏、薄荷脑等药物经适宜加工制成的中成药，收载于国家食品药品监督管理局标准[1]，具有清热泄火，通便的功效。临床用于咽喉肿痛，牙痛，头目眩晕，口鼻生疮，大便不通等。原标准只有大黄素、大黄酚的含量测定项，文献也无同时测定清火胶囊中靛玉红、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素和大黄酚5种成分的报道。研究参考有关文献[2-11]，建立HPLC法测定清火胶囊中大青叶的主要成分靛玉红，大黄的主要成分芦荟大黄素、大黄酸、大黄素和大黄酚含量的方法。该方法灵敏度高、简便、准确，可用于清火胶囊的质量控制。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agilent 1200系列高效液相色谱仪（Agilent 1200 LC色谱工作站、G1322A DEGASSER 溶剂脱气机、G1311A 四元泵、G1329A（ALS）自动进样器、G1314B VWD 紫外检测器）；德国赛多利斯 CP225D电子天平；西班牙COBOS AW-120自动电子天平；上海必能信SB3200WS 超声波清洗器。

1.2 材料 靛玉红（批号：717-200204）、芦荟大黄素（批号：110795-201007）、大黄酸（批号：0757-200206）、大黄素（批号：110756-200110）和大黄酚（批号：110796-201319）对照品均购自中国药品生物制品检定所。清火胶囊（批号：140111、141006，江西药都仁和制药有限公司；批号：140607，浙江泰康药业集团有限公司）。甲醇为色谱纯、水为超纯水，其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18（250×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇（A）-0.1%磷酸溶液（B），其梯度见表1；流速：0.8ml/min；检测波长：289 nm；柱温：30℃；进样量：10μl。理论板数按靛玉红计应不低于2500。

2.2 供试品溶液的制备 取本品10粒的内容物，精密稱定，研细，取约1粒的量，精密称定，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理（功率250W，频率40KHz）30min，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，滤液用0.45μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3 阴性对照溶液的制备 按处方中药味的比例，分别自配不含大黄和不含大青叶的群药，按其工艺制成阴性对照样品，再按供试品溶液制备方法制备阴性对照溶液。

2.4 系统适用性试验 分别取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液注入色谱仪，色谱图见图1。在该色谱条件下，靛玉红、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素和大黄酚与相邻组分峰的分离度均大于1.5，理论板数按靛玉红峰计不低于2500，阴性样品在与对照品色谱峰相应的位置上无吸收峰，表明处方中的其他成分对测定结果无影响。

2.5 线性关系的考察 精密称取靛玉红、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素和大黄酚对照品适量，以甲醇为溶剂，分别配制成对照品贮备溶液（即含靛玉红0.4996mg/ml、芦荟大黄素0.3910mg/ml、大黄酸0.3480mg/ml、大黄素0.2156mg/ml、大黄酚0.2119mg/ml的溶液）倍比稀释法配置成系列质量浓度的溶液。进样10μl，测定各组分峰面积。以各组分浓度（C）横坐标，相应峰面积（A）为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程。靛玉红： A=91.267 C+9.9152，r=0.9999，线性范围：0.050～5.00μg/ml；芦荟大黄素：A=38.850C-6.6232，r=0.9999，线性范围：0.391～39.1μg/ml；大黄酸：A=121.823C-12.269，r=0.9997，线性范围：0.696～69.6μg/ml；大黄素：A=83.911C-3.6159，r=1.0000，线性范围：0.216～21.6μg/ml；大黄酚：A=46.881C-1.5005，r=1.0000，线性范围：0.212～21.2μg/ml。

2.6 精密度试验 精密吸取同一供试品（批号：140111）溶液10μl，按上述色谱条件进样，测定靛玉红、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素和大黄酚的峰面积，重复进样6次，其RSD分别为0.76%、1.04%、1.28%、0.91%、1.46%。

2.7 [JP3]重复性试验 取同一批样品（批号：140111）共6份，精密称定，分别制备供试品溶液，各进样10μl，测定靛玉红、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素和大黄酚的含量，分别为：0.0075、0.0073、0.0073、0.0077、0.0077、0.0074mg/粒，平均：0.0075mg/粒（RSD为2.45%）；0.245、0.244、0.247、0.245、0.248、0.242mg/粒，平均：0.245mg/粒（RSD为0.87%）；0.100、0.096、0.097、0.099、0.095、0.098mg/粒，平均：0.098mg/粒（RSD为1.92%）；0.139、0.142、0.138、0.135、0.141、0.137mg/粒，平均：0.139mg/粒（RSD为1.86%）；0.530、0.536、0.534、0.525、0.529、0.528mg/粒，平均：0.530mg/粒（RSD为0.76%）。

2.8 稳定性试验 取同一供试品（批号：140111）溶液，分别在0、1、2、4、6、8、10、12h时进样10μl，记录色谱峰面积，计算靛玉红、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素和大黄酚的峰面积的RSD分别为0.59%、1.53%、1.28%、0.94%、1.62%。

2.9 加样回收率试验 精密量取已测定靛玉红、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素和大黄酚的清火胶囊（批号：140111）样品9份（每份约0.5粒的量），精密称定，于①②③样品中分别精密加入靛玉红、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素和大黄酚对照品贮备液4、150、60、150、600μl，于④⑤⑥样品中分别精密加入靛玉红、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素和大黄酚对照品贮备液8、300、120、300、1200μl，于⑦⑧⑨样品中分别精密加入靛玉红、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素和大黄酚对照品贮备液12、150、180、450、1800μl，制备供试品溶液，进样测定，计算加样回收率，结果见表2。

2.10 样品测定 取不同批号的清火胶囊，按供试品溶液制备方法处理，进行HPLC分析，以外标一点法计算靛玉红、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素和大黄酚的含量。结果见表3。

3 讨论

3.1 实验曾尝试用单一流动相甲醇-0.1%磷酸溶液（75∶[KG-*2]25）进行洗脱，部分组份分离效果不佳，加大水相组分的比例进行洗脱，结果发现分离效果大大提高，但出峰时间较长，影响工作效率；而选择现正文所用流动相，待测的5个成分分离较好且峰形较佳。

3.2 检测波长的选择：中国药典[2]收载大青叶中靛玉红检测波长为289nm，大黄中4个成分的检测波长为254nm，由于靛玉红含量较低，故选择289nm作为检测波长。

3.3 提取溶剂及时间的选择：分别用甲醇、乙醇、50%甲醇、50%乙醇作为提取溶剂超声提取，结果发现甲醇提取率最高。用甲醇超声提取30、40、50、60min等后进行对比考察，结果显示30min已经能够将目标组份提取完全。

3.4 由表3可知，不同厂家不同批号生产的清火胶囊中靛玉红、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素和大黄酚的含量有差别，特别是靛玉红的含量，差别很大，提示不同的生产工艺制备出的清火胶囊内在质量有差异。现有的清火胶囊的质量控制方法较简单，不能有效地控制清火胶囊质量。该方法经方法学研究表明，实验所建立的方法简单、可靠，可作为评价清火胶囊的质量标准之一。

参考文献

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（收稿日期：2016.04.07）