不同产地盐益智仁炮制前后白杨素的含量测定

苏胄豪 何月云 梁华伦 江秀娟 汪金玉 陈康

【摘 要】 目的：比较不同产地益智仁盐炙前后白杨素的含量差异。方法：采用高效液相色谱法，色谱柱：Kromasil C18色谱柱（250×4.6mm，5μm）；流动相：2.5%四氢呋喃甲醇-水梯度洗脱；流速：1.0ml/min，检测波长：269nm。结果：白杨素在0～13μg之间呈线性关系（r=0.9999），平均加样回收率为87.54%，RSD为1.93%（n=5）；有4个样品在炮制后白杨素含量增加，1个样品减少。结论：采用高效液相色谱法测定益智仁中白杨素含量的方法简单、快速，结果准确、可靠。

【关键词】 益智仁；白杨素；含量测定；HPLC

【中图分类号】R284.1 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2016）11-0014-03

Abstract：Objective To evaluate the content of chrysin in fructus alpiniae oxyphyllae from different producing areas after processed with salt. Methods The high performance liquid chromatography was used to detect the content of chrysin， with chromatography column （Kromasil C18， 250×4.6 mm， 5 microns）， mobile phase （2.5% of tetrahydrofuran in methanol-water， gradient elution） at 1.0 ml/min of flow rate， 269 nm of the detection wavelength， 26 ℃ of column temperature， and 30 μl of sample quantity. Results The linear range of chrysin was 0～13 μg， RSD was 1.93%（n=5）， and the average recovery rate was 87.54%. And the contents of chrysin of four samples were increased after processed， while one was reduced. Conclusion The high performance liquid chromatography （HPLC） method was developed for the determination of chrysin in fructus alpiniae oxyphyllae was simple， rapid， accurate and reliable.

Keywords：Fructus Alpiniae Oxyphyllae；Chrysin； Content Determination；HPLC

益智仁为姜科植物益智 Alpinia Oxyphylla Miq.的干燥成熟果实，主产于海南和广东，福建、广西、云南亦有栽培，是我国四大南药之一。益智性温味辛，归脾胃经，具有温脾止泻，摄唾涎，固精缩尿的功效。现代研究发现，益智仁主要有挥发油类、二芳基庚酮类、倍半萜类、黄酮类等成分。罗秀珍[1]等从益智仁中分得了黄酮类成分白杨素，但至今仍未见益智仁中白杨素含量测定方面的相关报道。药理研究证明，白杨素具有很好的抗肿瘤作用[2]，而益智仁也具有很好的抑制癌细胞增长的作用。因此，研究率先对益智仁盐炙前后白杨素进行了含量测定，建立了测定益智仁中白杨素含量的HPLC法，测定采集的5批10份益智仁饮片样品中白杨素的含量，并对其测定结果进行分析比较，为益智饮片质量标准的制定及炮制研究提供参考提供参考。

1 仪器及试药

1.1 仪器 天美LC2000型高效液相色谱仪（LC 2030检测器、LC 2130泵、L-2200自动进样器、T2000P色谱工作站）；BP 211D型电子分析天平（德国sartorius公司）；药用粉碎机LK-400（浙江城关红利数控制造厂）。

1.2 材料 白杨素对照品（批号：111701-200501，中国药品生物制品檢定所）。不同产地的5批益智药材经广州中医药大学中药学院高明副教授鉴定该5批皆为姜科植物益智Alpinia Oxyphylla Miq.的干燥成熟果实，见表1。甲醇为色谱醇，其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 色谱条件 色谱柱：安谱公司Kromasil C18色谱柱（250×4.6mm，5μm）；流动相：2.5%四氢呋喃甲醇-水，梯度洗脱，洗脱条件见表2；流速：1.0ml/min；检测波长：269nm；柱温为室温（26℃）；进样量：30μl。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取干燥至恒重的白杨素对照品适量，加甲醇使溶解，制成每ml含白杨素13μg的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 将各批益智仁饮片（生品/盐炙品）用粉碎机粉碎，过2号筛。取益智仁样品粉末约5g，精密称定，置于100ml圆底烧瓶中，加50ml乙酸乙酯，加热回流2h，静置冷却至常温，过滤，滤液定容至50ml，取定容后溶液10ml置分液漏斗中，等体积水萃洗三次，取萃洗后乙酸乙酯溶液5ml水浴挥干，残渣用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.3 线性关系考察 精密吸取白杨素对照品溶液0、1、2、5、10ml，分别置于10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，各取30μl注入液相色谱仪，按“2.1”项下的色谱条件进行测定，记录峰面积，得回归方程为白杨素Y=183.81X-6.4598，R2=0.9999，表明样品在0～13μg范围内呈良好的线性关系，见图2。

2.4 方法学考察

2.4.1 检测波长的确定 在200～800nm波长范围内，对对照品溶液和供试品溶液进行扫描，得白杨素的紫外吸收峰为212nm、269nm、313nm。综合考虑样品液的紫外吸收峰特点及色谱图基线、峰形及信号响应强弱，确定269nm为最佳检测波长。

2.4.2 流动相的确定 分别对常用的流动相系统及其不同比例进行等度、梯度洗脱试验。结果表明采用2.1项下的梯度条件进行洗脱效果为佳。

2.4.3 精密度试验 精密吸取白杨素对照品溶液，按2.1项下的色谱条件进行测定，连续进样5次，每次30μl，测定白杨素的峰面积值，其RSD为0.53%。表明仪器精密度良好。见表3。

2.4.4 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别在0、3、6、12、18、24h注入液相色谱仪，每次30μl，测定白杨素的峰面积值，其RSD为0.93%。表明供试品稳定性良好，在24h内检测不影响效果。见表4。

2.4.5 重复性试验 取同一批号的样品6份，按“2.2.2”方法制备供试品溶液，分别注入液相色谱仪30μl，测定白杨素的峰面积值，其含量的RSD为1.07%。表明本实验方法重复性好。见表5。

2.4.6 加样回收率试验 称取已测得白杨素含量的样品5份，精密加入一定量的对照品，按供试品溶液制备方法处理，分别取30μl注入液相色谱仪，测定白杨素的峰面积值，并计算回收率。结果平均回收率为88.40%， RSD为1.76%，见表6。

2.5 不同产地益智仁盐炙前后白杨素含量测定 取各批益智仁饮片（生品/盐炙品）用粉碎机粉碎，过2号筛。取益智仁样品粉末约5g，精密称定，按“2.2”项下方法制备各供试品溶液，精密吸取各供试品溶液 30μl，注入液相色谱，按“2.1”项下的色谱条件测定，记录峰面积，由回归方程计算其含量。测定结果益智仁饮片中白杨素的含量在24～35μg/g之间。盐炙品中白杨素的含量除三亚产样品外，其余四個产地均较生品有所增加。见表7，图3。

3 讨论

HPLC法测定益智仁饮片中白杨素的含量时，在样品制备方法上曾对三种提取溶媒进行了比较研究：甲醇、丙酮、乙酸乙酯，结果发现以乙酸乙酯为溶媒，白杨素的提取率较高且峰形较好，干扰成分少。同时，采用对回流、超声、索氏、石油醚脱脂后超声等不同提取方法也经行了优选，结果表明回流法提取率最高。最终确定选用乙酸乙酯回流提取的样品制备方法。在流动相的选择上，试验选择了多种流动相系统：甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.4%磷酸水及2.5%四氢呋喃甲醇-水等，同时对洗脱程序经行了优化，结果采用2.5%四氢呋喃甲醇-水系统梯度洗脱目标物质色谱峰分离效果最好，且保留时间短，适用于益智仁中白杨素的含量测定。

试验中，发现柱温对白杨素的分离及出峰时间都会有一定的影响，本次实验只是将仪器室温度控制在26℃，并没有对柱温的具体影响做详细考察，这方面还有待进一步的研究。另外，研究发现，益智仁经过盐炙后白杨素的含量所增加，但三亚产益智仁出现了相反的结果，具体原因有待进一步的探讨。

参考文献

[1]罗秀珍，余竞光，徐丽珍，等.中药益智化学成分的研究[J].药学学报，2000，35（3）：204-207.

[2]康颖，刘红光，曾谷清，等.白杨素对人胃癌SGC-7901细胞增殖与凋亡的影响[J].肿瘤防治研究，2007，9（34）：656-658.

（收稿日期：2016.04.07）