降解长链烷烃菌株的选育及性能研究

吕立君　王光华　李文兵　卢露露　刘念汝　陈彪　刘贝

(武汉科技大学化学工程与技术学院　武汉 430081)



降解长链烷烃菌株的选育及性能研究

吕立君王光华李文兵卢露露刘念汝陈彪刘贝

(武汉科技大学化学工程与技术学院武汉 430081)

摘要以正十六烷无机盐培养基为选择培养基，从武汉石化输油管附近土壤中筛选出1株高效降解长链烷烃的菌株，命名C3，对其进行生理生化、16S rDNA鉴定，C3为不动杆菌属。在正十六烷浓度为1 000 mg/L的无机盐培养基中接入4%的种子液，放入35 ℃、125 r/min摇床中震荡60 h，C3对正十六烷的降解率可达100%，其降解动力学拟合结果符合Monod模型。将C3应用到柴蜡的降解，96 h后，1 000 mg/L的柴蜡混合溶液的降解率能达到91%。C3产生的生物表面活性剂经鉴定为磷脂类活性剂，排油圈直径为80 mm，CMC约为35 mg/L，能将水的表面张力降低到20.79 mN/m。该菌株对长链烷烃的降解提供了良好的菌源。

关键词长链烷烃生理生化鉴定16S rDNA降解动力学生物表面活性剂

0引言

长链烷烃是严重破坏生态环境的有机污染物之一，由于其化学性质稳定、疏水性强、常温常压下为固体等特点，很难自然降解，会对环境造成长期的危害。经污水厂处理后的石化类废水仍含有大量的长链烷烃，被其他厂引作循环水而带入新一轮的生产中。刘雪琴[1]采用生物活性炭技术，对武钢焦化二沉池废水进行降解后，仍有部分长链烷烃未能被彻底降解。对武钢焦化厂蒸氨塔原水及循环水分别采用气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)进行定性分析，发现长链烷烃均来自循环水。

因此需针对未降解的长链烷烃继续筛菌，从而完善复合菌系，以达到更好的处理效果。由于长链烷烃的疏水性，需要筛选出一株能产生表面活性剂的菌株，来降低长链烷烃与水的表面张力。生物表面活性剂除了具有良好的降低表面张力、乳化、发泡的特性外，还具有易生物降解、无污染的优点，在化妆品、食品以及微生物采用中有广泛的应用潜力。

1材料与方法

菌种来源：采自武汉石化输油管附近的土壤。

培养基：无机盐培养基、LB培养基。

正十六烷含量测定：采用气相色谱仪Agilent 6890，色谱柱为HP-5毛细管柱；FID检测器；载气为高纯氮气。检测程序：检测器温度300 ℃；进样口温度300 ℃；分流比20∶1；载气流速1.5 mL/min；进样量1 μL。程序升温：

降解菌的富集和分离：

(1)降解菌的富集。将采集的样品，加入到装有100 mL无菌蒸馏水的锥形瓶中进行搅拌，静置后，取上清液5 mL加入到以正十六烷为唯一碳源，且正十六烷浓度为1 000 mg/L的LB液体培养基中，在125 r/min，35 ℃的恒温摇床中培养24 h，以获得大量菌群混合物。

(2)降解菌的分离。在相同条件下培养，驯化菌株，取5 mL菌悬液加入到无机盐培养基中，将正十六烷的浓度依次增加至2 000、3 000、4 000、5 000 mg/L，以增强菌株对正十六烷的降解能力。将驯化后的降解菌悬液稀释涂布到LB固体培养基上，于35 ℃生化培养箱中培养24 h，挑取单菌落划线分离，经多次纯化分离得到单一菌株，对其进行正十六烷降解试验，筛选出降解效果最佳的菌株。

菌株生理生化鉴定[2]。

16S rDNA分子遗传学鉴定[2]。

C3降解动力学研究。对于模型中的动力学参数的求解一般多采用Monod方程的线性简化公式[3-4]。

生物表面活性剂的研究：

(1)表面活性剂的提取与纯化[5]。

(2)表面张力的测定。采用JK99全自动张力仪测定吊环法测定表面张力。

(3)生物表面活性剂排油活性测定[6-7]。

(4)生物表面活性剂乳化性测定[6-7]。

(5)生物表面活性剂临界胶束浓度的测定[6-7]。

(6)生物表面活性剂红外分析[8]。

(7)采用薄层层析(TLC)法对菌株发酵产物进行薄层分离，然后根据不同显色剂的显色结果判断生物表面活性剂的种类，鉴定其属于糖脂、磷脂或者脂肽[8]。

2结果与分析

2.1长链烷烃降解菌的选育

将样品经过富集、分离和纯化，得到1株长链烷烃高效降解菌，命名为C3。

2.2C3菌株的生理生化特性

对C3进行生理生化鉴定，结果如表1所示，依据伯杰氏细菌鉴定手册，初步鉴定C3为不动杆菌属。

表1　优势菌生理生化实验结果

注：“+”表示试验呈阳性反应；“-”表示试验呈阴性反应。

2.316S rDNA分子遗传学鉴定

2.3.1PCR片段的序列分析

通过提取菌株C3的基因组DNA，将筛选出的PCR产物，送武汉擎科有限公司测序，测序后获得总长为1 411 bp的16S rDNA基因片段，该序列在GenBank中的登陆号为KR072554。

2.3.2序列同源性的分析

将测得到的菌株C3的16S rDNA序列输入NCBI网站，进行16S rDNA序列的同源性比对，该菌株C3的16S rDNA序列和Acinetobacter sp 16S rDNA序列相近，其同源性均大于97%。因此初步鉴定菌株C3为Acinetobacter sp(不动杆菌)。

将菌株C3的16S rDNA序列与GenBank中相关序列进行BLAST相似性分析后，以同源性高的11株菌株用Mega软件以相近序列构建系统发育树，结果见图1所示，C3在发育地位上鉴定为Acinetobacter sp，C3的亚种有待进一步分析。

图1　菌株C3的16S rDNA序列的系统发育树

2.4降解特性研究

在正十六烷浓度为1 000 mg/L的无机盐培养基中接入4%的种子液，放入35 ℃、125 r/min摇床中震荡60 h，C3降解正十六烷的生长曲线和降解曲线，如图2所示。菌株C3的生长趋势与对正十六烷的降解过程基本同步，表明该菌能利用正十六烷作为唯一碳源促进自身生长，并对正十六烷有良好的降解效果，培养60 h能将其降解完全。0～9 h，培养液中OD600较低，主要是因为正十六烷具有较强的疏水性，C3与正十六烷接触面小，因缺少碳源而生长较慢；9～42 h后，菌体光密度逐步增长，此阶段C3分泌了一种生物表面活性剂，降低了发酵液的表面张力，如图3所示，该表面活性剂对正十六烷具有增溶作用，能将发酵液的表面张力降低到20 mN/m左右，加大了C3与正十六烷的接触面；培养42 h后，菌株C3进入稳定期，生长速度与衰亡速度基本保持同步；培养51 h后，随着正十六烷的降解完全，C3因缺少碳源而进入衰亡期。

图2菌株C3对正十六烷的降解及生长曲线

图3发酵液表面张力的变化

为了了解菌株C3的降解规律，采用Monod方程为C3对正十六烷的降解模型。Monod方程表明底物浓度和降解速率之间的定量关系见下式：

(1)

式中，v、vmax分别为底物的生物降解速率和最大底物的生物降解速率，mg/(L·h)；Km是方程的半饱和常数，mg/L；S是底物浓度，mg/L。

对图2中正十六烷降解曲线中，对数期各点进行计算，得到各点的斜率即正十六烷降解速率v，正十六烷浓度倒数1/S以及速率倒数1/v，结果如表2所示。

表2　C3降解正十六烷S-v数据

图41/v～1/S关系

将C3运用到柴蜡混合物的降解中，在柴蜡混合物浓度为1 000mg/L的无机盐培养基中，置于125r/min，35 ℃的恒温摇床中培养96h。通过紫外分光光度法[9]，测定发酵液在225nm处的吸光值，得到柴蜡混合物的降解情况如图5所示。经过96h的培养，柴蜡混合物的降解率能达到91%，比马秋莎等[10]报道柴蜡混合物的降解率高4%。表明C3对废水中的长链烷烃的降解有着很高的应用价值，达到了筛菌目的。

2.5生物表面活性剂的研究

2.5.1表面活性剂的特性研究

提取发酵液中的生物表面活性剂，获得的产物为淡黄色粉状物质，产量为2.53g/L。排油圈大小为80mm。取一刻度试管，加4mL油和4mL发酵液，混合均匀后，在避光低温下静置，在不同时间测量乳化液和油相体积。每隔12h检测乳化体积的变化，连续监测72h，结果如图6所示，72h后乳化体积仍能达到60%以上。说明菌株C3产生的表面活性剂乳化性能稳定，具有很好的增溶效果。

图5柴蜡混合物的降解曲线

图6乳化性能的测定

图7临界胶束浓度的测定

将提取的表面活性剂分别稀释至5、10、15、20、25、30、35、40、45mg/L后，测定不同质量浓度的表面活性剂溶液的表面张力。测量结果如图7所示，当溶液浓度低于35mg/L时，随着浓度增加，水的表面张力相应降低，当样品浓度高于35mg/L时，增加样品浓度不能使水的表面张力进一步降低，表明C3菌株产物的临界胶束浓度约为35mg/L，能把水的表面张力降低到20.79mN/m。郑新伟[11]在论文中报道过多种表面活性剂降低水的表面张力的能力，C3产生的表面活性剂降低水的表面张力的能力能占到上游水平。

2.5.2表面活性剂的鉴定

生物表面活性剂红外光谱扫描结果如图8所示，3 436cm-1处为-OH吸收，1 649cm-1处为NH+吸收；1 543cm-1和1 389cm-1为C=O的吸收；1 079cm-1处可能是PO-R的吸收；950cm-1为P=0的吸收；668cm-1处为P=S的吸收，511cm-1为P-S的吸收。该表面活性剂初步鉴定为磷脂类，与RobertM等[12]研究一致。

取1mL发酵液离心，上清液用氯仿/甲醇：2/1(V/V)抽提后，进行薄层层析。展开剂为氯仿/甲醇/水：65/15/2(V/V/V)。选取高氯酸为显色剂，溶液显蓝色。与红外光谱扫描鉴定结果一致，可以判定C3产生的表面活性剂为磷脂类表面活性剂。

图8　菌株C3产生的生物表面活性剂的红外吸收光谱

3结论

(1)C3菌株经生理生化及16SrDAN鉴定为不动杆菌。

(3)将C3运用到1 000mg/L柴蜡混合物的降解中，经过96h的培养，柴蜡混合物的降解率能达到91%。说明了C3对长链烷烃有着良好的降解作用。

(4)C3菌株产生的生物表面活性剂经红外分析及显色反应，鉴定为磷脂类表面活性剂。排油圈大小为80mm，临界胶束浓度约为35mg/L，能将水的表面张力降低到20.79mN/m。

参考文献

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作者简介吕立君，女，硕士，研究方向为废水再生处理。

(收稿日期：2015-06-20)

Study on the Selection and Degradation Characteristics of Long-chain Alkanes Degrading Bacteria

LYU LijunWANG GuanghuaLI WenbingLU LuluLIU NianruCHEN BiaoLIU Bei

(CollegeofChemicalEngineeringandTechnology,WuhanUniversityofScienceandTechnologyWuhan430081)

AbstractWith the mineral salt medium with the n-hexadecane as the selecting medium, a strain that can effectively degrade the long-chain alkane is screened out from the soil near the pipeline of Wuhan Petrochemical Works，named as C3, conducted for physiological and biochemical identification and 16S rDNA comparison and the strain C3 is identified as Acinetobacter sp．The n-hexadecane degradation is 100%after 4%seed liquid of the strain is inoculated on the mineral salt medium with 1 000 mg/L of n-hexadecane and cultured at 35 ℃、125 r/min for 60 h, in accordance with Monod equation. The degradation of diesel and paraffin mixture can reach 91% after 96 h. The biosurfactants produced by strain C3, is identified as phospholipids, whose oil spreading size is 80 mm，the CMC of purified product is 35 mg/L, and the lowest surface tension is 20.79 mN/m. The study has provided the good resources of the microbial strain for degrading long-chain alkane.

Key Wordslong-chain alkanephysiological and biochemical identification16S rDNAdegradation kineticsbiosurfactants